《Agriculture, Ecosystems & Environment》：Unveiling the dominant role of soil pH in shaping nitrogen cycling microbial gene abundances: Insights from 65-years of chemical fertilizer selection in an acidic grassland meadow
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为探究长期施用化肥如何影响酸性草地微生物氮循环基因丰度及N2O排放，研究人员开展了长达65年的定位施肥试验。研究发现，相对于施肥带来的短期养分变化，土壤pH是塑造固氮和反硝化相关基因丰度的主导因素。该研究强调了在酸性土壤管理中，调控pH对于优化微生物功能和减少温室气体排放的关键意义。
在全球农业生产日益依赖化学肥料以保障粮食供给的背景下，化肥的长期、高强度使用所带来的生态环境问题也日益凸显。其中，氮肥在提高产量的同时，也深刻影响着土壤中驱动氮素转化的微生物过程。这些过程不仅关系到作物对养分的利用效率，更与温室气体氧化亚氮（N2O）的排放紧密相连。N2O作为一种强效温室气体，其百年尺度的全球增温潜势是二氧化碳（CO2）的273倍，对气候变化的影响不容忽视。因此，理解施肥如何塑造土壤氮循环微生物群落及其功能，对于发展可持续农业、减缓环境污染至关重要。尽管已有大量研究探讨了氮肥的影响，但在酸性草地生态系统中，关于磷、钾肥以及它们与氮肥配施的长期效应如何影响微生物氮循环基因丰度和N2O排放，仍然所知有限。尤其是在长期施肥背景下，究竟是肥料提供的养分直接驱动了微生物变化，还是施肥引起的土壤性质（如酸碱度）改变发挥了更关键的作用？这一问题尚待解答。为此，由Akari Mitsuta、Késia Silva Louren?o、Mart Ros、Yoshitaka Uchida和Eiko Eurya Kuramae组成的研究团队，在荷兰瓦赫宁根一个始于1958年的奥塞坎彭长期草地试验站开展了一项深入研究。该试验站土壤为强酸性粘壤土，研究人员系统分析了长达65年不同化肥处理（包括单施P、K、PK、N、NPK以及分季施用PK+N）下，土壤氮循环关键功能基因的丰度变化及其与环境因子的关系，旨在揭示长期施肥影响酸性草地氮循环微生物功能的深层机制。
为开展这项研究，作者团队主要运用了以下几项关键技术方法：首先，依托始于1958年的奥塞坎彭长期草地定位试验的样本队列，设计了包括对照、单施P、K、PK、N、NPK和PK+N在内的七种处理，并在2022年春季和夏季的七个时间点进行土壤和气体样本采集，以考察季节动态。其次，采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术，定量分析了与氮循环相关的多个功能基因的绝对丰度，包括固氮基因（nifH）、氨氧化基因（amoA-AOA、amoA-AOB、amoA-comammox）、反硝化基因（nirK、nirS、nosZ）以及硝酸盐异化还原成铵基因（nrfA）。同时，对土壤pH、矿质氮、有效磷、交换性阳离子等化学性质进行了系统测定。最后，利用闭室技术和腔衰荡光谱气体分析仪原位监测了CO2和N2O的排放通量，并结合冗余分析、随机森林模型和混合线性模型等多种统计方法，深入解析了基因丰度、环境因子与温室气体排放之间的复杂关系。
1. 氮循环微生物基因丰度
研究结果表明，施肥处理对总古菌、总细菌以及大多数氮循环功能基因的丰度有显著影响。具体而言，施用含氮肥料（N、NPK、PK+N）会降低nifH、nirK、nirS、nosZ和nrfA基因的丰度，同时提高amoA-AOA和amoA-AOB的丰度。其中，完全氨氧化菌（comammox）的amoA基因丰度仅在NPK处理中显著高于对照。相比之下，单施磷肥对大多数氮循环基因丰度无显著影响，而单施钾肥则显著降低了总细菌、amoA-AOA和nirK-I的丰度。
2. 土壤化学性质对基因丰度的影响
长期施肥显著改变了土壤化学性质。含氮肥料的施用增加了土壤矿质氮含量，含磷处理提高了有效磷水平，含钾处理则提高了交换性钾含量。尤为重要的是，施肥深刻改变了土壤pH：单施磷肥（过磷酸钙）使土壤pH略有升高，而所有含氮处理均显著降低了土壤pH，其中PK+N处理的酸化效应最强。冗余分析表明，土壤pH、湿度和N2O排放是解释微生物基因丰度变异的最重要环境因子。随机森林分析进一步确认，土壤pH是预测nifH、amoA-comammox、nirK-I、nirS-I和nosZ-II等基因丰度的最关键正相关因子。回归分析也显示，这些基因的丰度与土壤pH呈显著正相关关系。
3. CO2和N2O排放
CO2排放通量在不同处理间无显著差异。N2O排放则在所有含氮处理中显著升高，但在不同含氮处理（N、NPK、PK+N）之间无显著差异。相关性分析发现，N2O排放与氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）的基因丰度呈显著正相关，而与反硝化菌和硝酸盐异化还原成铵菌的基因丰度呈显著负相关。N2O排放与（nirK+nirS）/nosZ或（nirK+nirS）/nrfA的基因丰度比值无显著关联。
4. 讨论与结论
本研究最重要的发现是，在酸性草地生态系统中，长期施肥引起的土壤pH变化，比施肥带来的养分（氮、磷、钾）有效性短期波动，更能主导固氮菌和反硝化菌基因丰度的分布格局。例如，即使养分输入相似，土壤pH更低的PK+N处理其nifH、nirK、nirS和nosZ基因丰度也显著低于pH相对较高的NPK处理。这表明，当土壤pH低于4.5时，微生物氮循环基因丰度对pH的变化极为敏感，长期施肥管理导致的土壤酸化效应，可能掩盖了养分有效性本身的影响。相比之下，氨氧化微生物（AOA和AOB）的丰度主要受氮肥施用的正向驱动，尽管氮肥同时降低了土壤pH，这可能是因为它们作为自养微生物，对氮素可利用性的即时响应更为直接。特别值得注意的是，N2O排放与AOA丰度的正相关性比与AOB更强，这暗示在酸性土壤中，AOA可能在N2O产生过程中扮演着比以往认知更为重要的角色，其具体产排机制值得未来深入研究。季节变化导致的土壤湿度差异，则是影响nirK-II、nosZ-I和nrfA基因丰度的另一个关键因素。
综上所述，这项发表在《Agriculture, Ecosystems 》上的研究，通过长达65年的田间定位试验和深入的分子生态学分析，有力论证了在酸性草地中，长期化肥施用通过改变土壤pH这一核心性质，进而深刻塑造了氮循环微生物群落的功能潜力。研究结论挑战了仅关注养分输入的常规视角，强调在酸性土壤的可持续管理策略中，积极调控和维持适宜的土壤酸碱度，对于优化微生物介导的氮素转化功能、维持生态系统生产力以及减缓温室气体排放具有至关重要的意义。该研究不仅为理解长期农业活动下的土壤微生物响应提供了新见解，也为发展针对酸性土壤的精准施肥和生态管理措施提供了重要的科学依据。
