《Analytica Chimica Acta》：A dual-locked and self-feedback CHA-DNAzyme nanomachine for tumor-specific molecular imaging in living cells
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本研究开发了一种基于APE1/miR-21双锁定的自反馈CHA-DNAzyme级联放大平台，利用MnO2纳米花作为载体，通过分子自催化循环实现信号放大，检测灵敏度达34.6 fM，显著提升肿瘤细胞特异性成像和低丰度生物标志物检测能力。
Baizong Fang|Wei Guo|Zhenyu Liu|Huakui Huang|Xiaohong Zhong
中国南宁，广西医科大学玉林校区，530021
摘要：
背景
细胞内生物标志物的检测和成像可以为癌症的早期诊断提供重要信息。利用DNA固有的优势，如生物相容性、易于合成、可编程性和序列特异性识别，基于DNA的探针已被广泛用于生物标志物分析。目前，多种DNA探针与信号放大方法结合使用，以在活细胞中可视化生物标志物。然而，传统的单锁定DNA探针无法确保准确诊断。此外，缺乏高效的级联信号放大策略，使得检测和成像低丰度生物标志物变得具有挑战性。
结果
在这项工作中，我们报告了一种双锁定、自反馈催化发夹组装（CHA）-DNA酶级联放大平台，称为hMNS@SCD。该平台使用MnO2纳米花作为核酸载体和DNA酶辅因子补充物，并采用apurinic/apyrimidinic内切酶1（APE1）和miR-21作为两个分子钥匙。当存在APE1和miR-21时，发夹探针执行CHA循环，从而形成Y形DNA酶复合物。当存在Mn2+时，Y形DNA酶可以在MB上进行杂交-切割-释放循环，逐渐恢复Cy5荧光。此外，从MB释放的目标类似物可以触发新的CHA循环，生成更多的Y形DNA酶复合物并切割更多的MB，进一步放大荧光信号。通过自反馈CHA-DNA酶级联放大机制，hMNS@SCD有效提高了检测灵敏度，miR-21的检测限达到34.6 fM。实验数据表明，hMNS@SCD具有高灵敏度、选择性和生物相容性。
意义
我们构建了一种双锁定、自反馈的CHA-DNA酶级联纳米机器，能够实现肿瘤特异性分子成像，并有效区分正常细胞和癌细胞。此外，由于核酸探针的可编程性，这种策略可以很容易地适应其他低丰度生物标志物的检测和成像，为肿瘤特异性分子成像和早期癌症诊断提供了有前景的方法。
引言
细胞内生物标志物的检测和成像可以为癌症的早期诊断提供重要信息[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。利用DNA固有的优势，如生物相容性、易于合成、可编程性和序列特异性识别，基于DNA的探针已被广泛用于生物标志物分析。目前，多种DNA探针与信号放大方法（包括杂交链反应（HCR）、催化发夹组装（CHA）和DNA酶）结合使用，已在活细胞中可视化低丰度生物标志物，如蛋白酶[6]、[7]、微小RNA（miRNAs）[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]和金属离子[14]、[15]。尽管取得了相当大的进展，但依赖单一生物标志物的策略往往无法准确区分癌细胞和正常细胞。这是因为许多生物标志物不仅存在于癌细胞中，也存在于正常细胞中[16]、[17]、[18]、[19]。此外，传统的DNA探针通常处于“始终开启”模式，伴随信号泄漏，导致信噪比不利，不利于生物标志物的分析[17]、[20]。因此，开发具有信号放大的双生物标志物激活DNA探针对于活细胞中的特异性分子成像具有重要意义。
近年来，双锁定激活的DNA探针受到了越来越多的关注[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。例如，Ju等人开发了一种近红外（NIR）光激活放大器，用于放大miRNA成像[27]。尽管取得了一些进展，但肿瘤细胞特异性成像的挑战仍然存在。值得注意的是，Zhu等人通过整合CHA、HCR、DNA酶和自反馈等信号放大机制，开发了一系列AND逻辑调控的传感系统，实现了对双重疾病生物标志物的敏感检测[28]、[29]、[30]、[31]。双内源性生物标志物激活的DNA探针为肿瘤特异性成像提供了一种新方法。研究表明，apurinic/apyrimidinic内切酶1（APE1）在癌细胞中表达，而在正常细胞中不表达[32]、[33]、[34]、[35]。利用APE1在癌细胞和正常细胞中的表达差异，构建了几种APE1激活的DNA探针，这些探针有望用于准确区分癌细胞和正常细胞[36]、[37]、[38]。例如，Tang等人开发了一种APE1激活的CHA纳米机器，用于miRNA的精确成像[39]。最近，Wang等人设计了一种由APE1激活的CHA纳米马达，用于肿瘤细胞特异性分子成像[40]。然而，这些策略大多只具有单一信号放大功能或缺乏自反馈机制，导致信号放大能力有限，从而限制了灵敏度[41]、[42]、[43]、[44]。因此，构建由双内源性生物标志物激活的高放大级联策略仍然至关重要。
在这里，我们开发了一种内源性酶/miRNA双锁定、自反馈CHA–DNA酶级联信号放大策略，称为hMNS@SCD，用于肿瘤特异性和超灵敏的分子成像。该策略使用蜂窝状的MnO2纳米花（hMNS）作为核酸载体，通过谷胱甘肽（GSH）的降解实现DNA探针和Mn2+的细胞内特异性释放。癌细胞中过表达的APE1和miR-21作为两个“钥匙”，使级联放大电路的可编程启动成为可能。当APE1和miR-21共同激活时，双锁定的hMNS@SCD执行CHA循环，形成Y形DNA酶复合物。通过这种机制，分离的非活性DNA酶成分重新组成一个完整的、具有催化活性的结构。当存在Mn2+时，Y形DNA酶复合物在底物MB上执行连续的杂交-切割-释放循环，导致荧光逐渐恢复。同时，释放的miR-21类似物可以启动下一轮CHA-DNA酶循环，从而通过自反馈机制进一步放大荧光信号。与单锁定DNA传感器相比，这种APE1/miR-21双锁定的hMNS@SCD系统显著提高了癌细胞和正常细胞之间的区分能力。此外，自反馈CHA-DNA酶级联放大实现了超灵敏的生物标志物检测，检测限比非反馈CHA-DNA酶策略低8.96倍。重要的是，由于DNA序列的可编程性和生物相容性，这种双锁定传感平台具有巨大的潜力，为超灵敏、特异性的细胞内癌症生物标志物检测和成像以及更广泛的生物医学应用提供了有前景的途径。
材料与试剂
高锰酸钾（KMnO4）、油酸（OA）、四水合氯化锰（MnCl2·4H2O）、氯化钠、7-硝基吲哚-2-羧酸（NCA）、4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸钠盐（HEPES缓冲液）由Aladdin（中国上海）提供。人apurinic/apyrimidinic内切酶1（APE1）来自New England Biolabs Ltd。DNA Marker A、谷胱甘肽（GSH）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、加载缓冲液、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）等。
自反馈CHA-DNA酶系统原理
在这里，我们构建了一种双锁定和自反馈的CHA-DNA酶级联纳米机器，用于细胞内特异性分子成像。如图1A所示，这种DNA酶纳米机器由蜂窝状的二氧化锰纳米花（hMNS）组成，其中加载了四个发夹探针。hMNS既作为核酸载体，也作为DNA酶辅因子补充物。H1、H2和H3在5'和3'端嵌入了非活性的Mn2+依赖性DNA酶片段，H1还额外修饰了AP
结论
总之，我们构建了一种双锁定、自反馈的CHA-DNA酶级联纳米机器，能够实现肿瘤特异性分子成像，并有效区分正常细胞和癌细胞。与传统核酸探针不同，这种DNA酶纳米机器通过两个分子钥匙APE1和miR-21从“关闭”状态激活为“开启”状态。这种双锁定激活模式减少了信号泄漏，提高了肿瘤细胞识别的准确性。
CRediT作者贡献声明
Baizong Fang：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理。Xiaohong Zhong：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、资金获取、概念化。Huakui Huang：撰写——审阅与编辑、方法学、形式分析、概念化。Zhenyu Liu：可视化、验证。Wei Guo：方法学、研究、形式分析
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
广西自然科学基金（编号2025GXNSFBA069312）和广西大学中青年教师研究基础能力提升项目（编号2025KY0148和2024KY0125）。
