PVA改性降低了PVDF的疏水性，从而实现了蛋白质和糖链的同时分析

《Analytica Chimica Acta》：PVA Modification Mitigates PVDF Hydrophobicity for Concurrent Protein and Glycan Analysis

本研究开发了一种新型糖蛋白质组学方法，通过将聚偏氟乙烯（PVDF）膜浸入聚乙烯醇（PVA）溶液增加其亲水性，有效解决了糖蛋白电转印膜上糖链释放效率低的问题。该方法实现了蛋白质识别与糖分析同步进行，成功表征了血清载脂蛋白A1（ApoA1）在胰腺癌患者与健康人群中的糖基化差异，为糖基化生物标志物发现提供了新策略。

　　

刘刚|李玉清|王亚婷|范宁|李志|董伟杰

中国辽宁省大连市大连医科大学基础医学科学学院，116044

摘要

糖基化是蛋白质的一种关键翻译后修饰，它在多种生物和病理过程中发挥着重要作用。然而，传统的糖链分析方法（例如肼解、PNGase F酶消化）存在固有的局限性：这些方法在繁琐的纯化过程中常常会导致不可避免的糖肽损失，并且需要大量的样本材料。此外，来自重组糖蛋白的糖链谱型无法反映天然糖基化的组织特异性特征。在糖蛋白组学研究中，尽管SDS-PAGE被广泛用于糖蛋白样本的分离和纯化，但将糖蛋白电转印到PVDF膜上后释放糖链会面临诸多挑战——例如酶在膜表面的吸附以及杂质的干扰。为了解决这些问题，我们开发了一种新的糖蛋白组学策略：在糖蛋白转移后，将PVDF膜浸入聚乙烯醇（PVA）中以使其表面具有亲水性。这种亲水性使得转移到膜上的糖蛋白与酶能够充分接触，从而实现肽和糖链的有效释放。重要的是，这种方法允许对同一蛋白质样本同时进行蛋白质鉴定和糖链分析。利用这种方法，我们成功表征了胰腺癌患者和健康个体的血清载脂蛋白A1（ApoA1）的糖基化特征。这项工作为后续发现基于糖链的生物标志物奠定了坚实的基础。

引言

糖基化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一。由于糖蛋白连接的糖链具有内在的结构多样性和复杂性，它在许多生物过程中以及多种疾病的病理进展中起着关键作用，包括胚胎发育、细胞生长和分化、细胞间识别、信号转导和癌症进展等[1]。为了阐明糖蛋白的功能机制，需要深入分析糖链的组成和结构，这反过来又需要专门的分析技术。在传统方法中，这一过程通常从将糖链从其母蛋白中分离开始。

传统分析方法的核心在于将糖链从蛋白质中高效分离出来。典型的技术流程包括使用化学方法（例如肼解）或酶学方法（例如PNGase F）从糖蛋白中释放糖链部分[2, 3, 4]，然后从反应混合物中分离和纯化自由糖链，最后利用多种技术（例如质谱（MS）、核磁共振（NMR）光谱或高效液相色谱（HPLC）结合顺序外切糖苷酶消化）对糖链进行结构表征[5, 6, 7]。尽管这些技术为阐明糖蛋白结构（特别是糖链结构）与蛋白质功能之间的相互关系提供了重要基础，但它们仍受到技术限制的制约。一方面，对于使用MALDI-TOF MS的研究团队来说，该技术极易受到基质干扰和样品杂质的干扰[8]。因此，在肼解或PNGase F消化后，需要大量的纯化步骤来获得高纯度的糖蛋白样本。不可避免地，纯化过程中的样品损失会导致总糖蛋白产量的大幅减少，这不仅妨碍了对整个糖蛋白群体的全面分析，还可能导致关键糖链修饰信息的遗漏[9]。相比之下，LC-MS流程可以通过在线液相色谱分离有效减少基质干扰，从而大大降低样品预处理和纯化的要求[10, 11]。多个研究小组已经成功利用LC-MS对整个或未分馏的样本进行了糖基化谱型的分析，例如通过直接分析未纯化的细胞裂解物或在LC-MS检测前将细胞裂解物固定在PVDF膜上[12]。另一方面，糖基化修饰表现出明显的细胞/组织特异性。因此，即使有足够的重组糖蛋白用于结构分析，所得数据也常常无法再现天然糖基化的功能特性。因此，开发避免繁琐纯化步骤、最小化样品损失并准确捕捉天然糖基化的细胞和组织特异性的分析技术对于克服当前研究瓶颈并更深入地了解糖基化的生物学作用至关重要。

在糖蛋白组学研究中，SDS-PAGE被广泛用于样品的分离和纯化，特别是对于微量糖蛋白，凝胶电泳甚至可以作为最终的纯化步骤。如果后续实验需要糖链分析，则必须从嵌入凝胶中的糖蛋白或固定在PVDF膜上的糖蛋白中释放糖链[13, 14]。虽然从凝胶嵌入的糖蛋白中释放糖链在技术上是可行的，但由于两个核心限制，这种方法在实际应用中很少采用。一方面，在酶促糖链释放之前，凝胶基质需要经过彻底的脱色和脱盐处理，这通常会导致部分样品损失，从而影响后续糖链分析的灵敏度和准确性。另一方面，凝胶基质本身的性质和残留试剂也会显著影响酶促消化的效率[13]。相比之下，从转移到PVDF膜上的糖蛋白中释放糖链的方法已被许多研究小组广泛采用，其中固定在PVDF膜上的样本被用作糖链/糖肽分析的起始材料[6, 15]。虽然这种方法避免了基于凝胶的糖链释放所需的脱色和脱盐步骤，但它受到PVDF膜强疏水性的固有缺陷的影响。PVDF膜通过疏水相互作用结合蛋白质[16]，这种特定的结合方式可能导致酶分子在膜表面的非特异性吸附，从而降低糖链释放的效率。因此，有效抑制酶在膜表面的吸附是实现从PVDF结合糖蛋白中释放糖链的前提。为了解决这个问题，研究团队通常在酶促消化前用聚乙烯吡咯烷酮40000（PVP-40）预处理PVDF膜，从而阻断酶与膜之间的疏水结合[6, 17]。然而，即使经过彻底清洗，残留的PVP-40仍然存在并干扰后续的糖链分析[18]。因此，从PVDF固定的糖蛋白中提取糖链仍然是基于MS的糖组学研究中的一个方法学挑战。此外，在对获得的糖链进行组成和结构分析后，通常需要进一步验证以确认它们与目标糖蛋白的对应关系，从而确保结果的准确性。在这种情况下，如果一个PVDF电转印的糖蛋白斑点可以同时用于糖链分析和肽质量指纹图谱（PMF）分析，将减少样品消耗和分析时间，并显著提高数据准确性[19]。

在这里，我们描述了一种新的糖蛋白组学方法，该方法能够对PVDF膜上电转印的糖蛋白同时进行蛋白质鉴定和糖链分析。在该过程中，糖蛋白转移后，将疏水的PVDF膜浸入聚乙烯醇（PVA）中以使其表面具有亲水性，从而确保糖蛋白与酶（例如胰蛋白酶、PNGase F）之间的充分接触，从而促进高效的酶促消化和肽及糖链的释放。利用这种方法，我们成功获得了胰腺癌（PC）患者和健康个体（正常对照，NC）血清样本中载脂蛋白A1（ApoA1）的糖基化谱型和糖链模式，显示出促进糖链生物标志物发现的巨大潜力。

部分摘录

血清样本

血清样本来自中国大连医科大学附属的大连市中心医院（n = 6名正常个体和n = 6名胰腺癌患者）。这些患者的临床特征见补充表1（表S1）。所有患者均通过病理检查确诊，样本在手术或活检前获取。样本存储在-80°C直到进一步分析。每个样本在使用前解冻不超过两次。

Fetuin的纯化

我们尝试同时对糖蛋白进行糖链分析和蛋白质鉴定，首先通过SDS-PAGE分离糖蛋白，然后将其电转印到PVDF膜上。选择Fetuin作为模型糖蛋白，因为其N-连接和O-连接的糖链结构已经得到了很好的表征[14, 28, 29]。Fetuin（10 μg）通过SDS-PAGE分离并用Coomassie brilliant blue（CBB）染色。出乎意料的是，在55–70 kDa范围内观察到了两个主要条带（图1-i）。

结论

在这项研究中，我们建立了一种新的糖蛋白组学方法：使用亲水性聚合物（如PVA溶液）对PVDF膜进行亲水修饰，并通过优化实验确定了最佳条件为0.25%（w/v）PVA溶液和30分钟的孵育时间。这种PVA处理有效地抑制了胰蛋白酶或PNGase F酶对PVDF膜的非特异性结合，从而实现了N-连接和O-连接的糖链以及多肽的有效释放。

CRediT作者贡献声明

刘刚：撰写——初稿、方法学、数据分析。李玉清：撰写——初稿、数据分析。王亚婷：方法学、数据分析。范宁：软件、数据分析。李志：监督、软件。董伟杰：撰写——审稿与编辑、可视化、验证、监督、数据分析

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据将按请求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（资助编号32171280）、辽宁省教育厅的基本科学研究项目（LJ212510161029）以及大连医科大学的跨学科合作项目（JCHZ2023013）的支持。