《Applied Soil Ecology》：Three decades of green manure rotations sustain soil nitrogen supply by microbial functional restructuring under reduced mineral fertilization
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长期绿肥轮作结合减量施肥的稻体系统能够维持土壤总氮和有机碳水平，通过降低硝态氮还原酶活性、土壤pH和C/N比值，促进微生物群落功能重构，减少反硝化相关基因表达，从而实现氮循环保守与可持续供应。
卢阳|刘佳|黄俊杰|姜展|刘明|曹卫东
中国农业科学院油料作物研究所，农业农村部油料作物生物与遗传改良重点实验室，中国武汉，430062
摘要
绿肥作物被广泛采用以在减少化肥投入的情况下提高土壤氮（N）储量。然而，长期基于绿肥的稻米系统中控制氮循环的微生物机制仍不够清楚。通过一项为期31年的田间试验，比较了全量施肥（F）的传统稻-稻-冬季休耕系统与采用绿肥的轮作系统（稻-稻-中国牛奶豆或稻-油菜轮作），后者减少了50%的化肥用量（50%F + M 和 50%F + R），我们结合了土壤基本性质、酶活性以及微生物的分类和功能特征。尽管化肥投入减少，但包含绿肥的处理方式仍保持了土壤总氮和有机碳（C）的水平，同时硝酸还原酶活性平均降低了62.8%，pH值降低了8.1%，C/N比降低了5.9%。氮供应的持续性与微生物群落的功能重组有关，表现为异化硝酸盐还原（如narH和napA）和氨化（如nirB和nrfA）相关基因的丰度下降，尤其是反硝化相关基因（如norB和nosZ）下降了9%–17%，表明氮损失途径被下调。随机森林分析和相关性分析确定，pH值和C/N比的轻微但显著的降低是这一变化的关键土壤驱动因素。较低的pH值可能直接抑制了关键酶的活性，而C/N比的降低可能限制了能量密集型还原途径所需的电子供体。宏基因组组装进一步显示，在15个细菌宏基因组中，有13个含有编码多步骤氮转化相关酶的基因。总体而言，这些变化使土壤氮循环向保守方向转变，保持了净矿化作用和氮的有效性。我们的研究为设计可持续的基于绿肥的种植系统提供了机制框架，这些系统利用土壤-微生物的协同作用来增强氮的保持能力并减少对合成投入的依赖。
引言
在减少合成氮（N）投入的情况下生产丰富的食物是全球集约化农业面临的挑战（Chen等人，2014年）。在中国，76.5%的稻田接受的化肥氮超过了作物需求（Zhuang等人，2022年）。全球范围内，越来越多地采用绿肥作物来提高土壤碳（C）和氮（N）储量，同时减少环境影响并维持作物生产力（Xu等人，2021年；Yang等人，2019b年）。最近的一项多地点多年研究表明，将绿肥作物与40%的化肥替代相结合，可以实现与传统全量施肥相当的稻米产量，同时显著减少活性氮损失以及碳和氮的足迹（Gao等人，2023年）。这种可持续性是通过大气中的氮固定补充土壤氮、最小化氮损失以及促进有机氮的微生物矿化来实现的。然而，基于绿肥的稻米轮作系统中控制氮循环的微生物机制仍不够清楚。
土壤微生物被广泛认为是不同生态系统中氮转化的关键驱动因素（Kuypers等人，2018年）。农业实践，包括作物多样化和施肥制度，已知会重塑土壤微生物群落的组成和结构，从而影响微生物的复杂性和稳定性（Gao等人，2023年；Yang等人，2019a年；Zhou等人，2023年）。值得注意的是，土壤细菌多样性的下降与作物多样性减少和长期依赖化学肥料有关（Kong等人，2023年；Wang等人，2023年）。这种微生物多样性的丧失或群落简化可能会破坏氮循环过程并增加氮损失潜力（Bender等人，2023年；Philippot等人，2013年）。除了群落组成之外，越来越多的研究强调功能特征而非分类身份在控制生物地球化学过程中起着重要作用。这基于微生物之间的广泛功能冗余性，即环境选择特定的功能基因而非特定物种（Burke等人，2011年；Louca等人，2016年；Louca等人，2018年；Nelson等人，2016年）。因此，阐明绿肥应用如何调节土壤微生物群落的分类组成以及更关键的功能特征，对于在减少矿物肥料投入的稻米轮作系统中维持氮供应能力至关重要。
土壤氮转化包括六个主要途径：有机氮降解、同化（包括异化和同化硝酸盐还原）、硝化、反硝化、厌氧氨氧化和氮固定（Kuypers等人，2018年）。虽然多样化的种植系统通常会增加与N?O排放和氨氧化相关的微生物基因的丰度（Linton等人，2020年），但氮循环基因丰度的响应高度依赖于具体情境，会因多样化持续时间和生态系统类型等因素而变化。相比之下，矿物肥料通常会增加大多数氮循环基因的丰度，除了amoB、nirS或nifH（Sun等人，2023年；Tang等人，2016年）。包含绿肥的稻米生产不仅替代了化学肥料，还增加了种植多样性。尽管研究表明，绿肥应用可以增加高地土壤中关键氮循环基因的绝对丰度（如amoA、narG、nirS和nosZ）（Zhou等人，2023年），但其效果在稻田中取决于化学肥料投入和残余物管理（Gao等人，2020年；Yang等人，2019a年）。尽管有这些发现，但在基于绿肥的稻米轮作中，整体微生物氮循环途径对作物多样化和化肥减少的响应仍不清楚。
为了解决这些问题，我们对中国南部一个持续31年的稻-绿肥轮作系统的土壤样本进行了扩增子和宏基因组测序。我们假设，长期结合绿肥并减少化肥投入的轮作可以通过调节促进氮矿化和减少氮损失的关键微生物功能特征来维持土壤氮的有效性和供应能力。具体来说，本研究旨在：i）阐明长期包含绿肥如何在减少化肥投入的情况下选择性地重塑微生物的分类和功能特征；ii）确定多种氮循环途径如何响应这些低投入绿肥和稻米轮作中微生物分类和功能结构的变化。通过将微生物变化与土壤氮供应能力联系起来，本研究将为基于绿肥的系统的养分管理提供机制理解和关键见解，并为以较低氮投入维持稻米生产提供实用策略。
田间试验和处理
1990年，在中国江西省鹰潭市（28°15′30″N，116°55′30″E）建立了一个长期田间试验站点。该地区具有亚热带季风气候，年平均气温为17.6°C，降水量为1795毫米（Xia等人，2023年）。土壤来自第四纪红黏土，被归类为Dystric Clayic Plaggic Anthrosol（世界土壤资源参考基地，2014年），质地为黏壤土（沙子35.1%，粉砂33.9%，黏土31.0%）。初始有机碳（SOC）含量为
土壤生化性质和酶活性
与全量施肥对照（F）相比，两种包含绿肥的处理方式（50%F + M 和 50%F + R）平均降低了8.1%的土壤pH值和5.9%的C/N比，同时保持了土壤总氮（TN）和有机碳（SOC）水平。绿肥处理还显著降低了土壤碱度（AP）和阳离子交换容量（AK），但对硝酸根（NO??）、铵离子（NH??）、铵态氮（DON）和有机质分解产物（DOC）的浓度影响很小（表1）。与此一致的是，培养实验表明，绿肥处理保持了净氨化和硝化速率基于长期绿肥的稻米系统在减少矿物肥料投入的情况下维持了土壤氮供应能力
通过包含绿肥的轮作或间作，种植系统的时空多样化受到了前所未有的关注（Gao等人，2023年）。在我们的31年研究中，两种绿肥处理方式都保持了与全量施肥对照相当的土壤TN和SOC水平（表1）。这一发现与先前的研究结果一致，即减少化肥投入并结合绿肥轮作可以减少氮淋失，减轻温室气体排放，并同时提高氮利用效率（Abdalla等人，结论
根据本研究的结果，我们提出了一个示意图，展示了长期使用绿肥和减少化肥投入的稻米轮作对土壤微生物组与土壤氮循环相关功能特征的影响（图7）。我们的31年田间研究表明，长期结合绿肥并减少矿物肥料投入通过重塑土壤微生物组来维持土壤氮供应。这种变化由两个关键的土壤因素驱动，即降低的土壤pH值和
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利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金 [32202616; 42267046; 42177294]、农业农村部和农业农村部中国农业研究系统 [CARS-22]以及中国农业科学院的农业科技创新计划[CAAS-ASTIP-2021-OCRI]的支持。
