《Archives of Medical Research》：Initial Cell Seeding Density in Culture Influences Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Proliferation, Expansion and Differentiation
编辑推荐：
通过体外培养CD34+造血细胞亚群，研究不同初始细胞种植密度（CSD）对增殖、扩增和分化的影响。结果显示低密度（1细胞/孔）仅50%细胞增殖，高密度（1000细胞/孔）促进红系祖细胞生成和加速分化。中间密度（10-100细胞/孔）更利于扩增但高密度导致存活率下降。研究揭示CD34+CD38-细胞对微环境依赖性高于CD34+CD38+细胞，为优化造血干细胞培养提供新视角。
瓦莱里亚·埃利奥萨-加西亚（Valeria Eliosa-García）|帕特里夏·弗洛雷斯-古兹曼（Patricia Flores-Guzmán）|安赫利卡·穆尼兹-里维拉-坎巴斯（Angelica Mu?iz-Rivera-Cambas）|伊坦迪·弗洛雷斯-阿尔代（Itandi Flores-Alday）|赫克托·马亚尼（Hector Mayani）
墨西哥墨西哥城，墨西哥社会保障研究所（Instituto Mexicano del Seguro Social）二十一世纪国家医疗中心（Centro Médico Nacional Siglo XXI）肿瘤学研究部门（Oncology Research Unit），造血干细胞实验室（Hematopoietic Stem Cell Laboratory）
背景
初始细胞接种密度（CSD）已被确定为影响体外造血细胞生长动态的关键参数。在本研究中，我们评估了不同接种密度下造血细胞的生长情况。
方法
培养了两种造血细胞群体：CD34
+ CD38
–细胞（富集的造血干细胞）和CD34
+ CD38
+细胞（富集的造血祖细胞），接种密度分别为1、10、100或1,000个细胞/100 μL/孔。在整个14天的培养过程中，监测了这些细胞的增殖、扩增和分化情况。
结果
当接种密度为每孔1个细胞时，仅有50%的细胞能够增殖，这一现象在两种细胞群体中均有观察到。在较高的接种密度（100或1,000个细胞/孔）下，所有培养孔均显示出细胞增殖。这表明要么是不增殖的细胞在周围细胞的影响下开始增殖，要么是增殖的细胞覆盖并弥补了不增殖的细胞。中等接种密度（10或100个细胞/孔）有利于细胞扩增，而高接种密度（1,000个细胞/孔）则会导致细胞存活率下降。较高的CSD似乎有利于红细胞祖细胞的生成并加速细胞分化。
结论
我们的结果表明，CD34
+ CD38
–细胞在培养过程中比CD34
+ CD38
+细胞更依赖于周围细胞。需要进一步研究以阐明在如此低的细胞密度下控制原始造血细胞分裂的真正机制。
引言
造血过程是指一小部分造血干细胞（HSCs）产生多种成熟血细胞（如红细胞、白细胞和血小板）的过程（1,2）。HSCs具有自我更新能力，并能分化为所有类型的血细胞。HSCs的直接后代是造血祖细胞（HPCs），这是一种非常异质的细胞群体，包括多能细胞、寡能细胞、双能细胞和单能细胞，它们都具有较高的增殖潜力，但无法自我更新。HPCs进而产生形态可识别的前体细胞，这些前体细胞完成成熟过程后形成完全分化的循环血细胞。造血过程发生在骨髓中，具体是在所谓的造血微环境中进行的，该环境由称为造血龛（hematopoietic niches）的特定细胞微区构成（3）。在这些龛中，HSCs和HPCs通过多种机制（如细胞间接触和可溶性分子的分泌）受到不同类型细胞（龛细胞）的调控（4）。
HSCs和HPCs的生长和发展取决于内在因素和外在因素。内在因素包括细胞内的所有遗传和分子成分，这些成分决定了细胞的增殖、扩增和分化潜力，例如细胞因子受体、信号转导分子途径以及核转录因子。外在因素则包括构成造血龛的所有细胞和分子成分（5,6）。在体外培养条件下，外在因素包括培养基类型、使用的细胞因子组合、是否存在基质细胞、培养温度、培养基更换频率以及初始细胞接种密度（7,8）。所有这些因素都对体外HSC/HPCs扩增系统的发育至关重要（9）。
研究表明，培养开始时的细胞接种密度是实现半固体培养中最佳菌落生长和液体悬浮培养中细胞总数显著增加的关键因素（10,11）。然而，标准液体培养中的细胞数量通常非常高，根据输入的细胞群体不同，每毫升细胞数量可能在5,000到200,000个之间。尽管在几周后细胞数量可以显著增加，但由于大量细胞紧密相互作用，很难准确评估细胞密度对HSCs和HPCs增殖、扩增和分化的具体影响。因此，无法确定细胞邻近性和细胞接触在HSC/HPCs生长中是否起作用，以及其作用程度如何。
为了进一步了解细胞接种密度在液体培养中对造血细胞生长的影响，本研究分别以非常低（每孔1个细胞，含100 μL培养基）、低（每孔10个细胞）、中等（每孔100个细胞）和高（每孔1,000个细胞）的密度培养了两种富含HSCs和HPCs的细胞群体，并监测了它们在14天培养过程中的增殖、扩增和分化情况。
细胞采集、处理、富集和纯化
UCB（脐带血）样本来自墨西哥社会保障研究所的多家医院，并由IMSS脐带血库提供。采集过程遵循机构规定。细胞处理步骤如下：通过离心（400 g，7分钟）获得白细胞层，然后使用Ficoll-Paque Plus（Pharmacia Biotech，乌普萨拉，瑞典）分离出低密度单核细胞（MNCs），其密度低于1.077 g/mL。随后对MNCs进行了进一步处理...
细胞群体组成和细胞周期状态
从UCB中获得了两种CD34+细胞群体（CD34+ CD38–和CD34+ CD38+）。如表1所示，CD34+ CD38+细胞占CD34+细胞的近90%，这与先前的研究结果一致（17, 18, 19）。两种细胞群体在LTC-IC和CFC含量方面存在显著差异（CD34+ CD38–细胞和CD34+ CD38+细胞的LTC-IC和CFC含量较高）。在两种细胞群体中，超过90%的细胞处于G0/G1细胞周期阶段（表1；补充图示）...
讨论
细胞间的邻近性和相互作用已被认为是培养动物细胞生长的关键因素（20）。与此观点一致，初始细胞接种密度也被认为是影响体外半固体和液体培养中造血细胞生长的关键参数（10,11）。本研究探讨了不同接种密度（1、10、100、1,000个细胞/100 μL/孔）对两种不同造血细胞群体增殖、扩增和分化的影响...
资助
本研究得到了墨西哥人文科学、科学和技术委员会（Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología；CONAHCYT）的财政支持，资助编号为PRONAII-303048，资助对象为HM。
数据获取
本文所用的数据包含在文章本身中。如需更多数据，请联系相应作者。
