《Bioactive Materials》：NIR-II aggregation-induced emission sonosensitizer for pyroptosis induction in bladder cancer
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为克服传统声敏剂聚集导致淬灭(ACQ)的局限并提升声动力治疗(SDT)疗效，研究者基于苯并噻二唑设计了一种新型聚集诱导发射(AIE)声敏剂BBTPA，并将其与ROS响应聚合物PMD共组装为NPBBTPA纳米粒。该纳米粒在超声(US)刺激下高效产生活性氧(ROS)，诱导膀胱癌细胞线粒体损伤和GSDME介导的细胞焦亡，进而触发免疫原性细胞死亡(ICD)并增强抗肿瘤免疫应答。此项研究为开发兼具NIR-II成像与高效治疗功能的膀胱癌诊疗一体化平台提供了新策略。
膀胱癌是全球范围内复发率和死亡率都较高的恶性肿瘤，传统的治疗手段如手术、化疗和放疗虽然有效，但常常伴随着明显的副作用，并且对于晚期患者疗效有限。因此，迫切需要开发兼具高特异性和微创性的新型治疗策略。声动力治疗（Sonodynamic Therapy， SDT）作为一种新兴疗法，利用超声波激活肿瘤部位富集的声敏剂，产生具有细胞毒性的活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS），从而杀伤肿瘤细胞。它具有穿透深度大、无创、副作用小等优点，展现出巨大的潜力。然而，传统声敏剂材料常常面临一个棘手的问题：聚集导致淬灭（Aggregation-Caused Quenching， ACQ）。简单来说，这些分子在溶液中表现良好，但一旦在肿瘤部位聚集起来，发光和产生ROS的能力反而会大幅下降，严重限制了治疗效果。为了打破这一瓶颈，科学家们将目光投向了具有相反特性的聚集诱导发射（Aggregation-Induced Emission， AIE）材料。AIE材料在分散状态下几乎不发光，但在聚集状态下荧光会显著增强，这正好契合了在肿瘤富集部位高效工作的需求。不仅如此，AIE材料通常还具有优异的光稳定性和生物相容性。更重要的是，一些先进的AIE材料能够发射处于第二近红外窗口（NIR-II， 1000-1700 nm）的光，相比于传统荧光成像，NIR-II成像具有组织穿透更深、空间分辨率更高、自体荧光干扰更小的优势，能够实现更精准的肿瘤定位和治疗过程实时监控。将NIR-II成像功能与基于AIE的声动力治疗结合起来，构建“诊疗一体化”平台，成为精准肿瘤学领域一个极具吸引力的研究方向。
在此背景下，长春理工大学化学与环境工程学院的单美欣、王新伟、王竹、徐纯、李雷娇、李文亮、肖海华与瓦日斯力江·瓦哈甫团队在《Bioactive Materials》上发表了一项研究。他们成功设计并合成了一种基于苯并噻二唑、具有AIE特性的新型声敏剂BBTPA，并通过与一种ROS响应的聚合物PMD以及两亲性聚合物DSPE-PEG2000共组装，构建了纳米颗粒NPBBTPA。该研究旨在探索这种新型纳米平台在超声激活下，能否高效产生ROS，诱导膀胱癌细胞发生一种特殊的、伴有强烈免疫刺激作用的程序性细胞死亡——细胞焦亡（Pyroptosis），并进一步激发抗肿瘤免疫反应，从而实现高效的声动力免疫联合治疗。
研究者主要运用了以下关键技术方法：1. 有机合成与表征：通过Suzuki-Miyaura偶联等反应合成BBTPA及其前体，并利用核磁共振氢谱（1H NMR）、质谱（MALDI-FTICR-MS）、紫外-可见吸收光谱（UV-VIS）和荧光光谱进行表征与光物理性质分析；通过密度泛函理论（DFT）计算分子轨道和单线态-三线态能隙（ΔEST）。2. 纳米材料制备与表征：采用纳米沉淀法制备NPBBTPA纳米颗粒，利用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、Zeta电位分析其形貌、尺寸和稳定性。3. 体外生物学评价：使用膀胱癌细胞系（如UMUC3、MB49）进行细胞摄取（共聚焦显微镜CLSM、流式细胞术）、ROS生成检测（流式细胞术、CLSM使用DCFH-DA探针）、细胞毒性评估（MTT法、活/死细胞染色）、线粒体功能检测（JC-1染色、膜电位流式分析、透射电镜TEM观察）、细胞焦亡与免疫原性细胞死亡（ICD）相关指标检测（蛋白质印迹法Western blot检测GSDME、Cleaved-Caspase3；酶联免疫吸附测定ELISA检测炎症因子；CLSM观察HMGB1和钙网蛋白CRT的易位）。4. 转录组学分析：对处理后的细胞进行RNA测序（RNA-seq），并进行差异基因表达、KEGG通路富集和基因集富集分析（GSEA）。5. 体内药效与成像评估：使用C57BL/6小鼠构建皮下MB49膀胱癌模型，通过尾静脉注射NPBBTPA后进行NIR-II荧光活体成像，观察纳米颗粒的肿瘤靶向性与分布；在超声照射下进行抗肿瘤治疗，监测肿瘤体积和体重变化；治疗结束后，取肿瘤组织进行组织病理学（H&E染色）和细胞凋亡（TUNEL染色）分析。6. 体内免疫应答分析：通过流式细胞术详细分析肿瘤组织、脾脏和淋巴结中免疫细胞的变化，包括树突状细胞（DC）的成熟（CD80+CD86+）、自然杀伤细胞（NK细胞）的活化（NK1.1+CD69+KLRG1+）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的极化（M1/M2比例）以及CD8+T细胞的浸润（CD3+CD8+）。
2.1. BBTPA的合成与表征
研究者首先合成了目标化合物BBTPA，并证实其具有扩展的π共轭系统，在四氢呋喃中最大吸收波长红移至856 nm，并在900-1400 nm范围内有强荧光发射，峰值在1119 nm，具备NIR-II成像潜力。溶剂依赖性荧光光谱实验表明，BBTPA在不良溶剂甲苯中荧光强度显著增强，证实了其AIE特性。理论计算显示其具有较小的单线态-三线态能隙（ΔEST= 0.91 eV），有利于发生系间窜越（ISC），从而促进ROS生成。
2.2. NPBBTPA的制备与表征
为解决BBTPA水溶性差的问题，研究者将其与ROS响应性聚合物PMD和DSPE-PEG2000共组装，成功制备了平均粒径约125.6 nm、分布均匀的球形纳米颗粒NPBBTPA。该纳米颗粒保留了BBTPA的NIR-II吸收与发射特性。电子顺磁共振（ESR）光谱和化学探针（DPBF、TMB）实验证明，NPBBTPA在超声（US）刺激下能有效产生I型（羟基自由基·OH）和II型（单线态氧1O2）ROS。同时，在过氧化氢（H2O2）模拟的氧化应激条件下，纳米颗粒发生降解，证实了其ROS响应性解离的特性。
2.3. NPBBTPA的细胞摄取、ROS生成能力和体外抗肿瘤活性
利用其自身荧光，研究发现NPBBTPA可被膀胱癌细胞UMUC3有效内吞，且摄取呈时间依赖性。在超声照射下，NPBBTPA处理组细胞内ROS水平显著升高。细胞毒性实验表明，NPBBTPA本身对细胞毒性很低，但与超声联用后，能显著抑制UMUC3、MB49和T24等多种膀胱癌细胞的活力，半抑制浓度（IC50）在33-42 μg/mL之间，活/死细胞染色结果也直观地证实了其超声激活的杀伤效应。
2.4. NPBBTPA在体外诱导线粒体损伤和细胞焦亡
共定位实验显示NPBBTPA主要定位于细胞线粒体。经NPBBTPA+ US处理的细胞，线粒体膜电位显著下降，透射电镜下可见线粒体肿胀、嵴结构破坏等损伤形态。Western blot分析显示，该处理组中剪切形式的Caspase-3（Cleaved-Caspase3）和GSDME-N片段（焦亡执行蛋白Gasdermin E的活性形式）表达量显著上调。共聚焦显微镜下可观察到细胞肿胀、膜起泡等典型的焦亡形态。此外，处理组细胞上清液中ATP、乳酸脱氢酶（LDH）以及炎症因子（TNF-α， IL-6， IL-18）的释放量均显著增加。这些结果表明，超声激活的NPBBTPA通过诱发线粒体损伤和ROS爆发，激活了Caspase-3/GSDME介导的经典细胞焦亡通路。
2.5. NPBBTPA诱导的ICD效应
免疫原性细胞死亡（ICD）的标志之一是损伤相关分子模式（DAMPs）的释放。研究发现，NPBBTPA+ US处理能促使高迁移率族蛋白B1（HMGB1）从细胞核转移到胞外，并驱动钙网蛋白（CRT）从内质网易位至细胞膜表面。将经不同方式处理的肿瘤细胞与骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）共培养后发现，NPBBTPA+ US处理组的癌细胞最能促进BMDCs的成熟（CD80+CD86+细胞比例最高）。这证明NPBBTPA诱导的焦亡具有免疫原性，能够启动抗肿瘤免疫应答。
2.6. RNA测序分析
对处理后的细胞进行转录组测序分析发现，NPBBTPA+ US处理能显著影响基因表达。KEGG通路富集分析显示，该处理抑制了与线粒体功能密切相关的代谢通路（如三羧酸循环TCA cycle、氧化磷酸化等），同时上调了包括IL-18在内的多种免疫刺激因子的表达。这从基因组层面证实了NPBBTPA通过破坏线粒体功能和重塑肿瘤免疫微环境来发挥抗肿瘤作用。
2.7. NIR-II荧光成像和NPBBTPA的生物安全性评估
在荷瘤小鼠模型中，尾静脉注射NPBBTPA后，通过NIR-II活体成像观察到纳米颗粒在肿瘤部位特异性富集，并在2小时左右达到峰值。治疗实验显示，NPBBTPA+ US联合治疗能显著抑制肿瘤生长，抑瘤率达70.5%，且对小鼠体重无显著影响，表现出良好的生物安全性。肿瘤组织切片H&E和TUNEL染色显示该治疗组存在大量细胞坏死和凋亡。
2.8. NPBBTPA+ US释放DAMPs诱导免疫应答
深入的流式细胞术分析揭示了NPBBTPA+ US治疗强大的免疫激活效果。在肿瘤组织和引流淋巴结中，成熟树突状细胞（DC）的比例显著增加。肿瘤微环境内的自然杀伤细胞（NK细胞）活化比例大幅提升，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）向具有抗肿瘤作用的M1型极化比例增加。最重要的是，肿瘤组织和脾脏中浸润的细胞毒性CD8+T细胞数量显著增多。免疫荧光染色也证实了肿瘤组织中Cleaved-Caspase3表达增加和CD8+T细胞浸润增强。
结论与讨论
本研究成功开发了一种基于AIE声敏剂BBTPA的纳米诊疗平台NPBBTPA。该平台巧妙地将NIR-II成像、超声激活的ROS产生、ROS响应性药物释放、线粒体靶向的细胞焦亡诱导以及免疫激活等多种功能整合于一体。研究系统地从分子、细胞到动物模型层面证实了其工作机制：NPBBTPA在超声作用下高效产生ROS，靶向损伤线粒体，进而通过激活Caspase-3/GSDME通路引发肿瘤细胞焦亡；这种焦亡并非“静默”的死亡，而是释放出HMGB1、CRT等“危险信号”，即免疫原性细胞死亡（ICD），从而募集并激活树突状细胞，最终驱动强大的抗肿瘤免疫应答，表现为细胞毒性T细胞和NK细胞的大量浸润与活化。
这项工作的意义在于：第一，它提供了一种克服传统声敏剂ACQ效应、实现聚集状态下高效ROS生成的新材料设计思路。第二，它首次将具有NIR-II成像能力的AIE声敏剂应用于声动力治疗，并系统阐述了其通过诱导焦亡来激活免疫的全新机制，为“声动力-免疫”联合疗法提供了坚实的理论和实验依据。第三，所构建的NPBBTPA纳米颗粒具有良好的生物相容性、肿瘤靶向性和明确的ROS响应性，展现出较高的临床转化潜力。总之，该研究不仅为膀胱癌的精准诊断和高效治疗提供了一个有前景的诊疗一体化候选方案，也为利用细胞焦亡这一特殊死亡方式增强癌症免疫治疗开辟了新途径。
