《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Atractylon induces autophagy-dependent apoptosis in hepatocellular carcinoma cells via inhibition of the PI3K/AKT/mTOR pathway
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肝癌细胞增殖受Atractylon抑制并诱导自噬依赖性线粒体凋亡，其机制涉及PI3K/AKT/mTOR通路抑制及自噬体激活。
Jia Xu|Hongwu Yang|Hui Wei|Hongbing Li|Suqin Wang
淮安市中医院药学系，中国淮安223001
摘要
肝癌是导致癌症相关死亡的主要原因之一。调节细胞凋亡和自噬是治疗肝癌的有效策略。Atractylon是从大头苍术中分离出的一种主要成分。本研究探讨了Atractylon对肝癌细胞命运的影响及其作用机制。实验中，使用HepG2细胞并对其进行Atractylon处理，通过多种细胞和分子方法检测了细胞增殖、凋亡、自噬及相关信号通路。24小时的Atractylon处理降低了HepG2细胞的存活率并抑制了其增殖。Atractylon还刺激了线粒体凋亡，表现为Tunel染色阳性及线粒体膜电位（MMP）的丧失，同时Bcl-2下调、Bax上调，并激活了caspase-9和caspase-3。6小时的Atractylon处理抑制了HepG2细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，从而诱导了线粒体凋亡。12小时的Atractylon处理激活了自噬过程，而3-甲基腺嘌呤可以阻断Atractylon诱导的自噬，但氯喹或bafilomycin A1可以增强这一作用。此外，在HepG2细胞中，3-甲基腺嘌呤或自噬相关基因3（ATG3）siRNA可以消除Atractylon处理引起的MMP丧失和caspase激活，表明自噬激活是凋亡发生的前提。总体而言，Atractylon通过干扰PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导了依赖自噬的凋亡，这可能成为一种有前景的抗癌治疗候选物。
引言
肝细胞癌（HCC）是一种高度侵袭性和恶性的恶性肿瘤，对全球人类健康构成严重威胁。它通常发生在患有长期慢性肝病（如肝炎、纤维化和肝硬化）的患者中[1]。尽管已经采用了多种治疗方法，包括化疗、放疗、免疫疗法、手术切除、经导管动脉化学栓塞和肝移植，但早期诊断和干预对于患者的预后仍然至关重要[2]。随着精准医疗概念的推广，新的诊断方法（包括新兴的血清标志物、液体活检、分子诊断以及成像技术的进步）不断涌现[3]。目前临床实践中，针对癌细胞生物学关键过程的分子靶向治疗（如乐伐替尼、索拉非尼和瑞戈非尼）为HCC的治疗带来了新的希望[4]。其他潜在的药物靶点还包括生长因子，针对生长因子的靶向治疗有望与免疫检查点抑制剂联合使用，形成新的治疗策略[5]。因此，迫切需要进一步了解HCC的细胞和分子机制，并发现新的药物靶点。
程序性细胞死亡是一种主动的细胞死亡过程，包括凋亡、自噬、焦亡等，生物体可以利用这些过程清除异常细胞或应对应激信号[6]。虽然每种形式的细胞死亡都有其独特的特征，并由不同的调控机制控制，但这些途径之间存在相互作用和协同作用。凋亡是以非炎症方式协调清除死亡细胞的过程，分为由Bcl-2家族成员调控的内在途径和由死亡受体调控的外在途径[7]。自噬始于自噬体的形成，这是一种双膜结构，包裹着细胞质中的细胞器或大分子，最终会被降解。在此过程中，微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）通过自噬相关基因（ATG）7和ATG3介导的泛素化反应被激活[8]。此外，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是自噬的核心调控因子，通常受到磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路的调控[9][10][11]。重要的是，自噬在细胞命运决定中起着双向作用，其作用强度取决于诱导因子的强度[12]。适度和受控的自噬有助于细胞适应应激刺激，促进细胞存活[13]；然而，自噬失调与多种形式的细胞死亡有关，这些死亡过程统称为自噬性细胞死亡，可能是由于细胞存活相关分子和细胞器过度降解，或是由于关键结构（如内质网或细胞核）被自噬吞噬所致[14]。自噬性凋亡就是这种情况，其中失调的自噬会触发凋亡机制[15]。越来越多的证据表明，药物诱导的自噬性凋亡为癌症治疗提供了新的选择，并解释了许多抗癌药物的机制[16]。
天然产物是宝贵的抗癌候选物来源。Atractylon是一种特征明确的倍半萜单体化合物，具有抗炎、抗高血压、抗衰老和抗肿瘤活性[17]。例如，Atractylon通过阻断上皮-间质转化并降低MMP-2和MMP-9的表达，抑制了肝癌细胞的迁移和侵袭[18]。此外，Atractylon还调节了TMPOAS1和CCDC183AS1的表达，从而抑制了HCC细胞的侵袭和迁移[19]。最新研究表明，在适当浓度下，Atractylon通过抑制PI3K信号通路抑制了肠癌细胞的增殖并促进了凋亡[20]。然而，Atractylon在肝癌细胞中调节程序性死亡的机制尚不完全清楚。本研究首次证明Atractylon在HCC细胞中诱导了依赖自噬的凋亡，并将其与PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制联系起来。
细胞培养和实验处理
所有细胞系均购自ATCC（美国弗吉尼亚州）。本研究使用的细胞系包括：人肝癌HepG2细胞（RRID: CVCL_0027）和肝细胞LO2细胞（SNL-141）。细胞培养定期通过PCR检测支原体，并监测细菌、真菌或其他微生物污染的迹象。整个实验期间，所有培养物均未被污染。细胞培养使用90%的Eagle's Minimum Essential Medium进行。
Atractylon抑制HepG2细胞的生长
使用CCK-8实验评估了Atractylon（图1A）对HepG2细胞存活率的影响，结果显示Atractylon在24小时内以浓度依赖性方式抑制了HepG2细胞的存活率，IC50值为16.7 μM（图1B）。后续实验使用了10、20和40 μM浓度的Atractylon。此外，20 μM浓度的Atractylon在48小时内也以时间依赖性方式抑制了HepG2细胞的存活率（图1C）。
讨论
虽然已经进行了许多关于肝癌治疗方法的研究，但传统化疗方法总是伴随着严重的副作用[27]。草药或其活性成分由于副作用低且成本相对较低，值得在抗癌效果及其与西药协同作用方面进行探索。本研究发现Atractylon具有显著的
结论
本研究探讨了Atractylon如何调控肝癌细胞的命运，并揭示了其作用机制。结果表明，Atractylon在HepG2细胞中诱导了线粒体凋亡，且PI3K/AKT/mTOR通路的抑制促进了这种凋亡。进一步的分子分析表明，自噬的激活是Atractylon诱导线粒体凋亡所必需的（图6）。尽管本研究证明了
作者贡献声明
Hongbing Li：实验研究、数据分析。Hui Wei：数据分析、概念构建。Hongwu Yang：实验指导、数据分析。Jia Xu：数据管理、概念构建。Suqin Wang：写作——审稿与编辑、初稿撰写、实验指导
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性
本研究的数据可向通讯作者索取。
资助
本研究得到了淮安市科学技术局自然科学研发项目（HAB202035）的支持。
利益冲突声明
所有作者已阅读并批准了提交的稿件，同时声明没有利益冲突。
