《Biochemical Engineering Journal》：Synergistic pH and Feast-Famine Regulation of Polyhydroxyalkanoate Biosynthesis in a Methane?Oxidizing Bacterium
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Methylosinus sp. strain C49 (MC49)在pH5.5-8.0和氮限制feast-famine培养下表现出高效甲烷氧化及聚羟基烷酸酯（PHA）合成能力，pH7.5时PHA质量占比达53.8%，细胞阳性率95.3%，其代谢灵活性及工业应用潜力显著。
Jameil Magomnang|Shohei Yasuda|Shunsuke Hirai|Daisuke Inoue|Akihiko Terada
东京农工大学应用物理与化学工程系，日本东京小金井中町2-24-16，邮编184-8588
摘要
甲烷氧化细菌为减少温室气体排放和生产高附加值生物聚合物提供了一个有前景的平台。本研究在受控pH条件（5.5–8.0）和氮限制的“丰饶-饥饿”（F/F）培养模式下，研究了II型甲烷氧化菌Methylosinus C49菌株（MC49）生产聚羟基烷酸酯（PHA）的能力，旨在解决目前缺乏关于甲烷氧化菌细胞内PHA积累的pH和培养条件综合分析的问题。MC49在测试的pH范围内表现出稳健的甲烷氧化能力和化学计量一致性，在中性至微碱性条件下表现最佳。在pH 7.5、氮限制的F/F培养条件下，PHA产量达到53.8 wt%，其中95.3 ± 1.1%的细胞含有PHA，这一结果优于之前的MC49数据，并与其他甲烷氧化菌和异养PHA生产菌相当或更优。PHA单体组成（3-羟基丁酸酯（3HB）和3-羟基戊酸酯（3HV）受pH影响而发生定量变化，表明在无前体补充的情况下，甲烷氧化菌具有代谢灵活性。延长培养时间后，MC49在微酸性和碱性条件下仍能持续生长，进一步扩展了其已知的生理适应范围。总体而言，这些结果表明MC49是一种耐pH变化、高产率的甲烷氧化菌，并为在不同pH条件下优化甲烷到PHA的转化提供了机制和操作上的见解。MC49的稳健性和高PHA产率凸显了其在工业上将甲烷转化为生物塑料的巨大潜力，因为放宽pH控制可以降低运营成本，支持连续或半连续反应器操作，从而将富含甲烷的废物流转化为有价值的聚合物，为循环生物经济做出贡献。
引言
甲烷（CH4）是一种强效的短期气候污染物，在20年时间范围内其全球变暖潜能值（GWP）是二氧化碳的84–87倍，在100年时间范围内为27–30倍[1]、[2]。这种巨大的短期影响使得减少甲烷排放成为减缓近期全球变暖的关键策略。除了减排之外，甲烷还可以通过甲烷氧化菌作为能源，在生物过程中将甲烷氧化并将C1碳同化为生物量和代谢物[3]、[4]。特别是II型甲烷氧化菌可以通过丝氨酸循环将甲烷衍生的碳转化为乙酰辅酶A（acetyl-CoA），从而合成聚羟基烷酸酯（PHA）作为细胞内储存聚合物[5]、[6]。在PHA中，聚-3-羟基丁酸酯（PHB）是一种由3-羟基丁酸酯（3HB）组成的均聚物，具有显著的生物降解性和热塑性，使其成为生物塑料生产的理想候选材料[7]。
PHA是由微生物在营养受限条件下体内通过酶促反应合成的可生物降解聚酯，作为细胞内的碳和能量储存物质[8]、[9]。它们在多种环境中的可生物降解性以及替代传统塑料的潜力（传统塑料难以回收且会形成持久性废物）使得PHA成为可持续聚合物生产的理想选择[10]、[11]。除了作为生物塑料外，PHA（包括PHB）还发展成了多功能材料，应用于包装、纺织品、环境修复、医疗设备和消费品等领域，展现出跨行业的多功能性[12]。因此，PHA有望成为现代技术的关键材料，在商业应用之外带来可持续性和环境保护的好处[13]。
甲烷氧化菌中的PHA积累受到环境因素的强烈影响，尤其是pH值和营养物质的可获得性。培养pH值影响参与甲烷氧化、碳同化和PHA生物合成的酶的活性，从而调节生长和聚合物积累[3]、[4]、[14]。氮限制进一步增强了PHA的储存，因为当生长受到限制时，细胞会将多余的碳转化为聚合物[9]、[15]。“丰饶-饥饿”（F/F）培养策略通过在营养丰富和营养受限阶段之间交替，能够通过触发应激诱导的聚合物积累来最大化PHA产量[6]、[16]、[17]。
Methylosinus C49菌株（MC49）作为一种II型甲烷氧化菌，由于其高效的甲烷氧化能力、广泛的生理适应性和通过β-酮硫醇酶（PhaA）、乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB）以及PHA合成酶（PhaC）（由phaABC基因编码）进行聚合物生物合成的遗传能力，成为基于甲烷生产PHA的一个特别有前景的平台[6]、[18]。虽然之前的研究已经探讨了MC49的生长动力学和甲烷氧化情况，但尚未系统评估在培养pH值和氮限制的“丰饶-饥饿”操作共同影响下细胞内PHA生物合成的情况。特别是，pH值和培养条件对（i）总体PHA含量、（ii）PHA积累的群体均匀性以及（iii）单体组成（3HB/3HV）的综合影响，在II型甲烷氧化菌中仍缺乏定量研究。
为了填补这些空白，本研究首次系统地比较了在广泛pH范围（5.5–8.0）内标准（氮充足）和氮限制的“丰饶-饥饿”培养条件下Methylosinus C49的表现。通过整合甲烷氧化的化学计量、生物量生长、PHA总量测定以及通过荧光显微镜评估的单细胞PHA分布，我们阐明了pH值如何调节氮限制条件下的细胞内碳分配。这种综合方法对于深入理解基于甲烷的生物聚合物生物合成机制以及实现减少温室气体排放同时生产经济价值高的生物塑料具有实际意义。通过量化pH值对PHA产量、均匀性和单体组成的影响，本研究直接解决了环境和工业目标，促进了可持续和盈利的甲烷转化。此外，在无前体底物的情况下，还展示了pH值对3HB和3HV单体组成的调节作用，突出了内在的代谢灵活性而非外部驱动的共聚物形成。基于这些考虑，我们假设pH值和氮限制的F/F操作协同调节了MC49中的细胞内碳分配，在环境和经济相关条件下最大化了PHA的生产率和代谢灵活性。
总体而言，这些发现证实Methylosinus C49菌株是一种耐pH变化且高效的甲烷氧化菌，为在不同环境条件下优化甲烷到生物塑料的转化提供了机制和操作框架。
部分摘要
PHA积累培养
Methylosinus C49菌株（简称MC49）是一种从地下释放高浓度甲烷的稻田中分离出的II型甲烷氧化菌[19]。PHA生产的批量实验采用氮限制的“丰饶-饥饿”（F/F）模式进行了三次重复实验，利用了MC49的自然次级代谢特性：细胞首先在营养充足条件下生长（丰饶阶段），随后经历营养限制（饥饿阶段）以触发PHA积累
确认丰饶阶段甲烷过量
为了确保细胞内PHA积累所需的碳充足，在43天的培养期间监测了不同pH条件下的溶解甲烷浓度（图2）。在整个培养期间，甲烷浓度持续下降，反映了Methylosinus C49的活跃甲烷氧化作用。值得注意的是，在整个丰饶阶段甲烷始终处于过量状态，表明碳供应并未成为生长限制因素。
结论
Methylosinus C49菌株（MC49）在广泛的pH范围内表现出强大的甲烷氧化与细胞内聚羟基烷酸酯（PHA）积累结合的能力，显示出超出狭义实验室优化条件的内在生理稳健性。MC49在温和酸性和碱性环境中都能保持稳定的表现，这突显了其在甲烷转化方面的适用性
CRediT作者贡献声明
Jameil Magomnang: 文章撰写 – 审稿与编辑，原始草稿撰写，可视化数据制作，验证，方法论设计，实验设计，数据分析，概念构思。
Daisuke Inoue: 文章撰写 – 审稿与编辑，资源获取，方法论设计，数据分析。
Akihiko Terada: 文章撰写 – 审稿与编辑，验证，项目监督，方法论设计，资金筹集，概念构思。
Shohei Yasuda: 文章撰写 – 审稿与编辑，项目监督，资源获取，方法论设计。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
我们衷心感谢大阪大学的Ike Michihiko教授和Sato Taiga先生的宝贵技术支持，特别是在测量3HB和3HV浓度方面的帮助。同时，我们也感谢Kuroiwa Megumi教授在气体测量和分析方面的专业支持。本研究得到了日本科学技术机构（JST，项目编号JPMJPF2104）和日本学术振兴会（23K28255）的财政支持。
