结合二倍体化的酿酒酵母系统性代谢工程以提升酪醇产量

《Biochemical Engineering Journal》：Systematic Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae Combined with Diploidization for Enhanced Tyrosol Production

本研究通过代谢工程和二倍体化策略优化酿酒酵母的酪醇合成途径，包括增强前体供应、敲除竞争途径、过表达关键酶基因及利用酪氨酸正调控，显著提高了酪醇产量，摇瓶发酵达3.2 g/L，二倍体菌株ST8-2表现出工业应用潜力。

　　

赵曼|施俊彦|郑国飞|李硕|何思辰|刘志强|郑玉国

浙江工业大学生物技术与生物工程学院生物有机合成重点实验室，中国杭州310014

摘要

酪醇具有多种药用价值，在医药和食品等领域得到广泛应用。然而，植物提取效率低下，化学合成对环境有害。在本研究中，通过代谢工程和二倍体化改造了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），以实现高效酪醇生产。主要策略包括：增加磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的供应；通过过表达ARO4^K229L、ARO3^D154N和ARO7^G141S来缓解反馈抑制；通过敲除PHA2和HFD1阻断竞争途径；过表达相关基因（ARO1、ARO2、ARO10）；并以酪氨酸作为正向调控因子。构建了单倍体菌株ST8及其二倍体衍生物ST8-2。在摇瓶培养中，ST8和ST8-2的酪醇产量分别达到0.98 g/L和1.12 g/L，是野生型（0.06 g/L）的16.28倍和18.75倍。在5 L连续发酵过程中，ST8-2的酪醇产量为3.2 g/L（比ST8的2.3 g/L高39.13%），且生长速度更快。RT-PCR结果显示ST8-2中ald6、PYK1和ARO10的转录水平升高。本研究表明酿酒酵母在酪醇生产方面的潜力，二倍体菌株具有工业应用优势。

章节摘录

引言

4-羟基苯乙醇（酪醇）是一种酚类抗氧化剂，在调节植物生长发育中起着关键作用[1]、[2]、[3]。它具有多种生理活性，如抗菌、抗炎和抗肿瘤作用，并在血管保护、肝肾保护以及保健品开发方面具有应用价值[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。酪醇天然存在于橄榄、葡萄、Ligustrum lucidum和Rhodiola rosea中，但

CRISPR/Cas9技术在酿酒酵母中的应用

为了在酿酒酵母C00菌株中实现CRISPR/Cas9介导的基因编辑，首先将SpCas9基因整合到其基因组中，建立核心核酸酶表达系统。通过识别目标位点附近的原间隔序列（PAM）来定位突变位点，然后使用CHOP-CHOP在线工具（http://CHOPCHOP.cbu.uib.no/）设计突变引导RNA（gRNA），该工具还便于设计PAM位点的引物

酪醇合成主要途径的定向改造

芳香化合物通常对微生物具有毒性，高浓度的酪醇会抑制酵母生长[29]。为平衡酪醇生物合成与菌株存活率，采用了可诱导的启动子系统进行精细的代谢调控（图S1）。首先敲除GAL80基因，构建基础菌株ST0，实现半乳糖对目标代谢途径的调控。在此基础上，通过过表达相关基因开发了ST1菌株

结论

本研究通过整合代谢工程和二倍体化，建立了一种有效的提高酿酒酵母酪醇生物合成的策略。通过优化戊糖磷酸和糖酵解途径来系统改造前体供应，并利用ARO4^K229L、ARO3^D154N和ARO7^G141S突变体缓解反馈抑制，协同激活芳香氨基酸代谢，从而显著提高酪醇产量。

CRediT作者贡献声明

施俊彦：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，实验研究。

李硕：软件开发。

郑国飞：数据管理，概念构思。

郑玉国：资源获取，项目管理。

刘志强：撰写 – 审稿与编辑，项目监督，项目管理。

何思辰：数据可视化，结果验证。

赵曼：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，方法学设计。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢浙江省科技厅重点研究基金（2021C02064-5-4）的支持。同时感谢浙江工业大学分析检测中心在扫描电子显微镜分析方面提供的帮助。