《Biochimie》：Multiple strategies for HB-EGF inhibition: interference with receptor binding, ectodomain shedding and matricrine signaling
编辑推荐：
抑制heparin-binding EGF-like growth factor（HB-EGF）的多种策略，包括毒素衍生物CRM197/SbB阻断受体结合、蛋白酶抑制剂抑制胞外裂解、他帕林阻断结合位点，均能减少细胞增殖并诱导凋亡。
安德里·西罗莫洛特（Andrii Siromolot）|达里娅·茹科娃（Dariia Zhukova）|斯维特兰娜·罗马纽克（Svitlana Romaniuk）|德尼丝·科利博（Denys Kolybo）|谢尔希·科米萨连科（Serhiy Komisarenko）
乌克兰国家科学院帕拉迪恩生物化学研究所分子免疫学系，列昂托维奇街9号，基辅，01054，乌克兰
摘要
白喉棒状杆菌外毒素的无毒类似物可以抑制肝素结合型EGF样生长因子（HB-EGF）与肿瘤细胞受体的结合；通过靶向其肝素结合位点或阻止外域脱落，可以进一步破坏其通过旁分泌和基质分泌机制的信号传导。在本研究中，我们使用荧光HB-EGF衍生物通过流式细胞术评估了重组白喉毒素类似物CRM197及其B亚单位（SbB）对HB-EGF与EGFR结合的影响。通过MTT测定法，我们评估了HB-EGF与HSPG相互作用以及不同蛋白酶抑制剂处理对HB-EGF促进细胞增殖能力的影响。利用单一化合物及其混合物的IC50值计算了组合指数（CI），以评估不同机制的相互作用。CRM197和SbB能有效阻止外源性sHB-EGF与细胞的结合。此外，向细胞培养物中添加蛋白酶抑制剂可产生细胞抑制和细胞毒性效应。有趣的是，肝素并未增强处理后细胞的增殖活性，这可能是因为肝素与HB-EGF的肝素结合域结合，将其从与膜相关硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用中分离出来，从而阻止了基质分泌激活。这些发现表明，结合针对HB-EGF的策略可以显著降低有高EGFR和proHB-EGF表达肿瘤的促有丝分裂活性并诱导癌细胞死亡。
引言
肝素结合型EGF样生长因子（HB-EGF）对伤口愈合至关重要，因为它能促进伤口区域角质形成细胞和成纤维细胞的修复和肉芽组织形成[1]，而其在恶性肿瘤中的作用则构成了一个重要的治疗挑战。HB-EGF最初以膜锚定蛋白（proHB-EGF）的形式合成，随后通过解整合素和金属蛋白酶（ADAM）的作用被蛋白水解，生成具有促有丝分裂活性的14–20 kDa可溶性形式[2][3]。proHB-EGF作为一种旁分泌生长因子，以非扩散方式向邻近细胞传递信号，并且还作为白喉毒素（DT）的受体，帮助其进入细胞[4]。
HB-EGF在许多细胞类型中以低水平表达，在皮肤伤口、缺氧和氧化应激条件下表达增加，随着伤口愈合和组织再生而进一步升高[1]。
可溶性HB-EGF（sHB-EGF）对许多细胞类型具有强烈的促有丝分裂和趋化作用[5]。此外，它在病理生理过程中起着关键作用，包括癌症。它通过与EGFR亚型ErbB-1/HER1和ErbB-4/HER4结合并激活它们来发挥促有丝分裂效应。sHB-EGF诱导EGFR磷酸化，并随后激活下游信号级联反应，包括MAPK和PI3K/AKT级联[6]。STAT3和PI3K/AKT信号通路在调节基本细胞过程（如生长、迁移和增殖）中起着重要作用，对维持细胞功能和促进生存至关重要。这些通路的失调通常与癌变相关，导致细胞增殖失控、迁移能力增强和对凋亡的抵抗。在许多癌症中，STAT3和PI3K/AKT信号通路的持续激活驱动肿瘤进展，促进免疫逃逸，并增强治疗抗性，使其成为抗癌策略的有吸引力的目标[7]。
此外，EGFR家族成员的异常酪氨酸激酶活性与多种癌症类型的生长刺激和肿瘤发生有关，包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、脑癌和结肠癌。抑制和中和HB-EGF是一种用于阻止许多癌症的治疗策略[8]。
CRM197是一种无毒的白喉毒素衍生物，保留了其天然对应物的免疫原性，同时作为HB-EGF的精确抑制剂[9][10]。由于CRM197对proHB-EGF表达较低的细胞仅有轻微毒性，其细胞毒性似乎直接依赖于proHB-EGF的水平[11]。CRM197特异性结合人HB-EGF，通过阻止EGFR激活来抑制其促有丝分裂活性。
负责proHB-EGF外域脱落的金属蛋白酶（MMPs）在调节可溶性成熟sHB-EGF的释放中起关键作用，后者随后与EGFR结合并激活它们[12]。例如，ADAM 9在许多物种中保守存在，在兔子宫的胚泡着床部位高表达，表明ADAM 9对proHB-EGF的加工可能在着床过程中起重要作用[13][14]。然而，ADAMs 10和17被认为是proHB-EGF外域脱落的主要调节因子[15]。ADAMs揭示了EGFR配体加工（特别是HB-EGF）在调节其生物功能中的关键作用[16][17]。此外，靶向MMPs和ADAMs的活性可能是降低sHB-EGF促有丝分裂效力的潜在策略。研究表明，CRM197在卵巢癌治疗中可下调参与proHB-EGF外域脱落生成可溶性形式的MMP-9的mRNA水平[17]。此外，HB-EGF还结合MDA-MB-453细胞上的140 kDa受体，该受体被鉴定为N-精氨酸二碱性转化酶（NRD），属于M16家族的金属内肽酶[18]。虽然NRD作为HB-EGF的受体，但其酶活性独立于HB-EGF，不参与proHB-EGF的切割。相反，NRD调节HB-EGF诱导的细胞迁移，可能成为本研究中使用的广谱蛋白酶抑制剂的潜在靶点。
与大多数EGF家族成员不同，HB-EGF对肝素具有很强的亲和力[19]。细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）作为HB-EGF的高丰度但低亲和力受体[20]。HSPGs在各种细胞信号通路和肿瘤微环境中起关键作用，HB-EGF对HSPGs和肝素的亲和力尤其高。HB-EGF同时结合EGFRs和与细胞表面HSPGs结合的能力可能使其比其他EGF家族成员（如EGF和TGF-α）具有功能优势[21]。因此，HB-EGF的肝素结合域（HBD）是选择性抑制其功能的有希望的靶点。
针对HB-EGF的单克隆抗体是HB-EGF依赖性癌症治疗的基本工具；然而，迄今为止仅开发了有限数量的此类抗体[22][23]。在本研究中，我们旨在对几种抑制肿瘤细胞中HB-EGF依赖性促有丝分裂信号的互补策略进行比较功能分析。具体来说，我们考察了：（i）使用无毒白喉毒素衍生物（CRM197和SbB）直接阻断可溶性HB-EGF与EGFR的结合；（ii）使用蛋白酶抑制剂抑制proHB-EGF的外域脱落；以及（iii）通过掩盖其肝素结合域干扰HB-EGF的基质分泌信号传导。我们使用荧光HB-EGF衍生物、流式细胞术和细胞增殖测定法，评估了这些不同调节水平对HB-EGF在EGFR高表达肿瘤细胞中的生物利用度和促有丝分裂活性的影响。
部分摘录
模型、试剂和溶液
A431（ATCC CRL-1555）和Vero（ATCC CCL-81）细胞系由乌克兰国家科学院R.E. Kavetsky实验病理学、肿瘤学和放射生物学研究所提供。RPMI-1640和合格的FBS从Sigma-Aldrich和Gibco购买。GM6001（一种金属蛋白酶抑制剂）、蛋白酶抑制剂混合物（1x）和leupeptin从Thermo Fisher Scientific, Inc.购买。重组蛋白表达
本研究中使用的无毒白喉毒素衍生物CRM197是通过定向合成获得的
重组CRM197和SbB在原核细胞中表达
我们之前的研究表明，CRM197和SbB可以在30°C下成功表达为活性蛋白，并通过重折叠发挥作用[3]。细菌裂解物分析显示，所有重组DT衍生物在大肠杆菌中以包涵体的形式积累。为了生产CRM197和SbB，培养了携带相应基因构建的大肠杆菌 BL21 Rosetta (DE3)细胞，并用IPTG诱导蛋白质表达。His标记的蛋白质通过Ni2+-NTA琼脂糖纯化讨论
本研究提供了几种旨在在不同调节水平上抑制HB-EGF依赖性促有丝分裂信号的互补策略的机制比较，包括配体-受体相互作用、外域脱落和基质分泌激活。与仅针对单一分子靶点的方法不同，我们的结果突显了这些调节层在控制HB-EGF生物利用度和信号输出方面的功能相互依赖性。
本研究的一个关键发现是
结论
总之，本研究表明，可以通过多种互补机制有效调节HB-EGF的活性，包括抑制外域脱落、阻断配体-受体相互作用以及干扰由硫酸乙酰肝素蛋白聚糖介导的基质分泌信号传导。GM6001对金属蛋白酶的抑制强烈抑制了可溶性HB-EGF的释放，而CRM197和SbB选择性地阻止HB-EGF与EGFR的结合，从而减少了增殖信号传导
CRediT作者贡献声明
安德里·西罗莫洛特（Andrii Siromolot）：撰写——原始草稿、软件使用、方法学设计、实验实施、数据分析、概念化。谢尔希·科米萨连科（Serhiy Komisarenko）：撰写——审阅与编辑、资源提供、项目管理。德尼丝·科利博（Denys Kolybo）：撰写——审阅与编辑、原始草稿撰写、监督、资源提供、项目管理、概念化。斯维特兰娜·罗马纽克（Svitlana Romaniuk）：撰写——原始草稿撰写、数据可视化、方法学设计、数据分析。达里娅·茹科娃（Dariia Zhukova）：撰写——原始草稿撰写、数据分析
手稿准备中的人工智能辅助声明
本手稿的完善得到了基于人工智能的语言工具的帮助，包括Grammarly（Grammarly, Inc.）、Curie（Research Square Aje, LLC）和ChatGPT（OpenAI，美国加州旧金山），这些工具仅用于提高语法准确性、清晰度和风格一致性，以符合期刊的出版标准。作者确认这些工具未用于生成科学内容、进行数据分析或解释结果。资助
本研究由乌克兰教育和科学部（项目编号0123U104137，根据国家科学技术发展和产品订单）和乌克兰国家科学院（项目编号0115U003643，属于“分子和细胞生物技术用于医学、工业和农业需求”的综合多学科研究计划）资助。资助者在研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿准备方面没有发挥作用利益冲突声明
手稿《多种HB-EGF抑制策略：干扰受体结合、外域脱落和基质分泌信号传导》的作者声明没有利益冲突。致谢
我们感谢所有参与这项研究的同事和学生，以及为这项研究提供资金的机构。
