基于天然胶原蛋白的温敏性载药水凝胶，用于糖尿病伤口管理：通过调节炎症和促进血管生成实现治疗效果

《Biomaterials Advances》：Thermosensitive drug-loaded hydrogel based on natural collagen for diabetic wound management via modulating inflammation and promoting angiogenesis

糖尿病伤口愈合延迟与持续炎症和血管生成不足相关。本研究构建了一种天然胶原蛋白基热敏水凝胶，通过EDC/NHS交联和硫酸铵沉淀增强机械性能，负载左旋蜱螈内酯和铜离子。该水凝胶在生理温度（37℃）下实现药物控释，显著促进成纤维细胞和内皮细胞增殖迁移，抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子释放，并通过HIF-1α/VEGF通路增强血管生成。体内实验证实其能有效改善糖尿病大鼠伤口微环境，促进胶原沉积和表皮再生，为慢性伤口修复提供了新型多功能敷料策略。

　　

黄书凡|马海蒙|敖家琪|张世宇|高勤学|郭书婷|于青青|梁继超

湖北省高通量药物筛选技术国家与地方联合工程研究中心，湖北中医药生物技术重点实验室，湖北大学健康科学与工程学院，武汉，中国

摘要

持续的炎症反应和受损的血管生成都会导致糖尿病伤口愈合延迟。结合抗炎和促进血管生成的方法在糖尿病伤口管理中显示出巨大的潜力。本文构建了一种基于天然胶原蛋白的热敏水凝胶，其中封装了costunolide和铜离子。该胶原蛋白通过EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide）/NHS（N-hydroxysuccinimide）交联，并用硫酸铵浸泡以增强其机械强度。这种复合水凝胶能够在生理温度下释放costunolide和铜离子，并具有优异的生物相容性。实验表明，该水凝胶显著促进了成纤维细胞和内皮细胞的增殖，并增强了内皮细胞的迁移。同时，该复合水凝胶通过降低脂多糖（LPS）激活的巨噬细胞中的促炎细胞因子表达而发挥抗炎作用。此外，在糖尿病大鼠模型中，使用这种多功能水凝胶处理后，炎症微环境得到改善，血管生成增强，进而促进了细胞增殖、胶原蛋白沉积和上皮再生，最终加速了伤口愈合。因此，这种基于天然胶原蛋白的热敏多功能水凝胶作为一种先进的伤口敷料，为糖尿病伤口的治疗提供了一种新的治疗策略。

引言

根据最新的流行病学数据，近年来全球糖尿病的患病率呈持续上升趋势[1]。控制不佳的慢性高血糖可能导致一系列糖尿病并发症，包括糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病心血管疾病和糖尿病慢性伤口。伤口愈合是一个高度复杂的过程，主要包括止血阶段、炎症阶段、增殖阶段和基质重塑阶段[2]。这些过程按顺序进行，同时也会相互重叠。然而，在糖尿病伤口等慢性伤口中，愈合过程的有序进行受到严重干扰。持续的高血糖会导致糖尿病伤口部位的M1巨噬细胞持续激活，这些巨噬细胞会分泌大量的促炎细胞因子[3]。虽然短暂的炎症有助于清除病原微生物，但长期不受控制的炎症会引发氧化应激，并抑制巨噬细胞的M2极化，从而导致伤口愈合显著延迟。事实上，已有研究表明，在糖尿病伤口的愈合过程中，巨噬细胞的M2极化明显减少[4]。抗炎作用、抑制M1巨噬细胞极化以及促进M2巨噬细胞极化在糖尿病伤口的治疗中显示出巨大潜力。

血管生成在伤口愈合中起着关键作用，它提供代谢和营养支持以及氧气[5]。然而，慢性高血糖会引发局部血管损伤并抑制血管生成，从而导致糖尿病伤口愈合延迟。体外研究、动物实验和临床试验一致表明，促进血管生成可以加速糖尿病伤口愈合。铜离子已被证明具有促进血管生成的良好活性[6]。多种铜离子载体已被成功设计并应用于糖尿病伤口的治疗，取得了显著效果[7]。

水凝胶是一种高分子量材料，具有三维网络结构，可以在水中迅速膨胀并保持大量水分，由于其独特的自愈性、可控的药物释放和改善的生物利用度，被广泛应用于药物递送、组织再生、伤口愈合等领域[8]。水凝胶可以为伤口提供湿润的环境，促进营养物质和氧气的交换，改善伤口愈合的微环境[9]。具有高孔隙率和优异水合能力的水凝胶支架被广泛用作药物递送载体。基于胶原蛋白的水凝胶是很有前景的结构，常用于组织工程支架[10]。I型胶原蛋白已被证明是可生物降解和生物相容的，在细胞增殖、迁移和分化以及组织重塑中起着重要作用[11]。与合成胶原蛋白相比，天然胶原蛋白不仅具有更好的生物相容性，还含有更多的天然修饰成分和活性基团（如氨基和羧基），使其更容易进一步修饰成更复杂和稳定的三维结构[12]。基于胶原蛋白的水凝胶在当前应用中展现出巨大潜力，但也存在固有的局限性：较低的机械强度限制了其在开放性伤口中的使用，而不足的热稳定性限制了其在高温环境中的适用性。此外，大分子胶原蛋白容易引发免疫反应和炎症反应。因此，未来的研究可以集中在开发机械性能强、环保且低免疫原性的策略上，以同时提高机械性能、热稳定性和环境适应性。

铜离子（Cu²⁺）对许多基本代谢过程至关重要，如细胞代谢、组织修复和先天免疫发育[13]。作为一种必需的微量元素，Cu²⁺可以刺激细胞增殖、促进胶原蛋白沉积和血管生成[6][14]。这些过程对皮肤再生和血管生成至关重要。Cu²⁺还调节多种细胞因子和生长因子的分泌，这些因子几乎参与了伤口愈合的所有阶段。Cu²⁺主要通过铜离子转运蛋白（CTR1）进入细胞。它通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的作用加速VEGF的产生和血管生成。HIF-1α通过诱导VEGF和血管生成来加速伤口愈合过程，并调节血管内皮生长因子（VEGF）及其受体2（VEGFR2），这与血管的生理功能密切相关[15]。可以通过控制水凝胶中铜离子的释放来利用Cu²⁺作为治疗剂，以刺激细胞迁移并加速伤口愈合[16]。

糖尿病伤口治疗中的铜离子递送通常通过铜纳米颗粒封装或将铜加载到金属有机框架（MOFs）[7]、共价有机框架（COFs）[17]或合成聚合物中来实现[7]。然而，这些方法涉及复杂的制备过程，并导致生物活性铜离子的释放效率较低。此外，残留的纳米颗粒、MOFs、COFs和聚合物可能会引发免疫反应，它们的体内清除过程和动力学仍不完全清楚。相比之下，天然胶原蛋白成分明确，可被伤口部位的蛋白酶降解，具有高生物相容性和广泛的可用性。基于胶原蛋白的水凝胶只需直接加载微量铜离子即可发挥促血管生成作用。

Costunolide（Cosinolactone，COS）是一种主要的倍半萜内酯类生物活性化合物，最初从 Aucklandia lappa Decne 中分离出来[18]。目前，许多研究表明Costunolide具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用[19]。其直接的分子靶点（IKKβ）已被确定[20]，这突显了其在糖尿病伤口愈合中的巨大转化潜力。然而，其极低的水溶性严重限制了其实际应用。由于病理机制的复杂性，很少有药物或敷料被批准用于治疗糖尿病伤口。仅针对抗炎或血管生成的单一疗法难以达到满意的治疗效果。此外，尽管生长因子可以促进血管生成，但它们成本高昂且制备过程复杂。为了解决这些问题，我们开发了一种采用EDC/NHS交联策略并结合硫酸铵盐析效应的机械增强型胶原蛋白水凝胶。制备的水凝胶表现出温度敏感的药物释放特性。加载Costunolide和铜离子后，这种复合水凝胶显示出强烈的抗炎和促血管生成活性，并具有良好的生物相容性。体内研究表明，这种复合水凝胶可以促进糖尿病大鼠的伤口愈合，为慢性伤口修复提供了一种新的策略。

试剂和材料

Costunolide（COS）从成都Herpurify有限公司（中国成都）购买。EDC和NHS从Aladdin（中国上海）购买。Calcein-AM/PI由Solarbio科技有限公司（中国北京）提供。 Moist Exposed Burn Ointment（MEBO）从MEBO制药有限公司（中国汕头）购买。来自Clostridium histolyticum的胶原酶从Beyotime Biotechnology（中国上海）购买。所有其他化学品均可商业购买并使用。

水凝胶的制备和表征

作为皮肤中的主要结构蛋白，前胶原蛋白在细胞外基质（ECM）的形成中起着关键作用，并在伤口愈合的后期阶段对上皮再生至关重要[26]。酸溶性胶原蛋白（Asc）首先使用醋酸从大鼠尾腱中提取。经过透析后，胶原溶液冻干得到白色海绵状固体。通过0.1 M NaOH碱性预处理去除非胶原蛋白质，同时不损失Asc[27]。

结论

总之，我们成功合成了一种基于天然胶原蛋白的机械增强型载药水凝胶。制备的水凝胶表现出显著的温度敏感药物释放行为，从而能够在37°C的生理温度下实现天然产物Costunolide的原位释放，同时对高葡萄糖微环境引起的伤口炎症具有强烈的抑制作用。

作者贡献声明

黄书凡：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、数据管理。马海蒙：撰写——原始草稿、可视化、软件、方法学、研究。敖家琪：研究、数据分析。张世宇：研究、数据分析。高勤学：研究、数据分析。郭书婷：研究、数据分析。于青青：撰写——审阅与编辑、资源准备。梁继超：撰写——审阅与编辑、可视化、项目监督

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了湖北武当地方中医药研究重点实验室（湖北医科大学，WDCM2024006）的开放项目以及横向合作项目（编号：2022127002001002）的支持。