《Bioorganic Chemistry》：Bispecific aptamer LYTAC for PCSK9 degradation: a promising strategy for cholesterol regulation
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PCSK9-LYTAC双特异性适配体通过IGFIIR介导的溶酶体靶向降解PCSK9，同时阻断其与LDLR的结合，显著恢复肝细胞LDL摄取效率（22%），为心血管疾病治疗提供非抗体、模块化策略。
崔帅帅|李明杰|李向军|何宇健|吴莉
中国科学院化学科学学院，北京100049，中国
摘要
PCSK9是LDLR周转的关键调节因子，也是心血管疾病（CVD）的治疗靶点。本文报道了一种基于双特异性DNA适配体的溶酶体靶向嵌合体（PCSK9-LYTAC）的开发，该嵌合体通过IGFIIR介导的溶酶体运输促进PCSK9的细胞外降解。这种双适配体结构同时阻断PCSK9与LDLR的相互作用，并将PCSK9导向溶酶体降解。在HepG2细胞中，PCSK9-LYTAC能够有效定位到溶酶体，并显著恢复LDL的摄取（约22%），其效果优于相应的单价PCSK9适配体。机制上，这种功能恢复与PCSK9降解后细胞表面LDLR的可用性增加有关。总体而言，这些结果证明了基于适配体的LYTAC作为一种非抗体、模块化策略在调节细胞外蛋白质稳态方面的可行性，并强调了其在治疗血脂异常和CVD中的潜在应用。
引言
尽管在预防和治疗方面取得了显著进展，心血管疾病（CVD）仍然是全球主要的健康负担之一[1]。在风险因素中，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）被广泛认为是CVD的主要诱因。大量的临床和流行病学证据表明，降低LDL-C水平可以显著减少CVD的发生率[2]。他汀类药物被广泛用作一线治疗手段来降低LDL-C并预防心血管事件；然而，近一半的患者仅靠他汀类药物无法达到目标LDL-C水平[3]。此外，他汀类药物还伴随着不良反应，包括肌病、胃肠道不耐受以及新发糖尿病的风险增加[4]。因此，探索新的非他汀类治疗方法以进一步减轻CVD的负担是非常必要的。
近年来，为了满足LDL-C管理的临床需求，已经开发了几种非他汀类策略。其中，抑制前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型（PCSK9）这一LDL受体（LDLR）周转的关键调节因子，显示出特别的前景[5]。PCSK9与肝细胞膜上的LDLR结合，形成PCSK9–LDLR复合物，这些复合物通过内吞作用进入溶酶体并被降解，从而减少受体数量并降低LDL-C的清除能力[6]。针对这一途径，已有两种单克隆抗体和一种siRNA疗法获得FDA批准，它们在降低LDL-C水平和减少高胆固醇患者的CVD事件方面表现出显著疗效[7]，[8]。然而，基于抗体的疗法需要频繁注射，成本较高，并可能引发免疫反应，这会影响患者的依从性并限制其长期临床应用。相比之下，siRNA疗法具有每六个月给药一次的优势，提高了依从性，并降低了免疫反应的风险；但它依赖于专门的递送系统，其长期安全性和脱靶效应仍有待充分研究[9]。此外，PCSK9–LDLR相互作用是一种具有挑战性的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），其结合表面较长且相对平坦，缺乏明确的结合位点，使得传统的小分子抑制剂开发变得尤为困难[10]。尽管如此，最近的研究开始突破这一限制。一系列环状肽抑制剂已被成功开发[11]，其中Enlicitide癸酸酯（MK0616）是一种大环肽抑制剂，能够有效破坏PCSK9与LDLR的相互作用，并已进入三期临床试验，显示出降低患者LDL-C水平的显著效果[12]，[13]。同时，研究人员还开发了如AZD0780这样的新型小分子化合物，这是一种下一代口服PCSK9抑制剂，也显示出良好的临床潜力[6]，[14]。尽管取得了这些进展，但这些方法仍面临分子设计复杂性、反应持久性和长期安全性等方面的挑战，这突显了开发能够克服当前PCSK9靶向和其他非他汀类疗法局限性的创新化学策略的必要性。
虽然PPI传统上被认为是“难以成药”的靶点，但靶向蛋白质降解（TPD）的出现为解决这一挑战提供了新的途径。与传统的“占据驱动”抑制剂不同，TPD通过“事件驱动”机制发挥作用，利用细胞自身的降解机制来消除靶蛋白，从而消除其功能[15]，[16]。这一范式在药物发现和癌症治疗中显示出巨大潜力。虽然大多数TPD系统专注于细胞内蛋白，但最近开发的溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）平台已将这一概念扩展到细胞外和膜蛋白，为调节如PCSK9这样的分泌因子提供了有希望的途径。与抑制PCSK9活性或表达的抗体和siRNA不同，PCSK9-LYTAC通过溶酶体介导的运输促进PCSK9的细胞外清除，可能提供更长的药效时间和更低的给药频率。当与适配体技术结合时，LYTAC具备了独特的灵活性和实用性。适配体（常被称为“化学抗体”）具有高度的设计灵活性、可逆的结合特性、低免疫原性和易于化学合成/修饰的特点，能够实现可扩展和模块化的构建。对于像PCSK9这样的细胞外靶点，基于适配体的LYTAC避免了siRNA所需的复杂细胞内递送系统，同时避免了单克隆抗体带来的高生产成本和免疫风险。值得注意的是，Han及其同事最近报道了一种基于双特异性适配体的LYTAC（Ap-LYTAC），该LYTAC利用胰岛素样生长因子II受体（IGFIIR）介导膜蛋白的溶酶体降解[17]。
受此启发，我们设计并合成了一种针对PCSK9的Ap-LYTAC（命名为PCSK9-LYTAC），通过T4 DNA连接酶将PCSK9结合适配体与IGFIIR结合适配体连接起来。该结构不仅通过特异性识别阻断PCSK9与LDLR的相互作用，还通过IGFIIR的参与将PCSK9导向溶酶体进行高效降解（图1）。这种双重作用机制为调节CVD相关的血浆脂质稳态提供了强有力的策略，并为治疗由难以靶向的蛋白质引起的复杂疾病开辟了新的治疗途径。
结果与讨论
首先，我们设计并合成了PCSK9-LYTAC，这是一种由双DNA适配体驱动的溶酶体靶向嵌合体，旨在增强细胞外蛋白质降解的效率。该嵌合体由三个功能模块组成：（1）一个IGFIIR适配体，将靶分子特异性导向溶酶体进行降解；（2）一个对PCSK9具有高特异性的Pcsk9适配体；（3）一个连接子，用于稳定并连接这两个适配体，确保它们在细胞内的有效递送。
结论
总之，我们成功设计并评估了一种双特异性适配体结构PCSK9-LYTAC，它能够同时靶向PCSK9和IGFIIR。我们的结果表明，PCSK9-LYTAC与其靶蛋白保持高亲和力结合，从而保持了各个适配体的功能完整性。此外，我们发现PCSK9-LYTAC能有效抑制PCSK9与LDLR的相互作用，显著恢复了HepG2细胞中的LDL摄取。
作者贡献声明
崔帅帅：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。李明杰：验证、方法学、研究。李向军：可视化、概念化。何宇健：可视化、验证、概念化。吴莉：撰写——审阅与编辑、资金获取、概念化。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：21778054）、北京市自然科学基金（编号：2192058）以及中央高校基本科研业务费的支持。
