甲氧喹唑啉磺酰胺衍生物的合成与评估：作为兼具靶向肿瘤相关炎症和抑制EGFR三重突变双重功能的分子制剂

《Bioorganic Chemistry》：Synthesis and evaluation of methoxyquinazoline sulfonamide derivatives as bifunctional molecular targeting tumor related inflammation and anti-EGFR triple-mutation

18甲氧基喹啉并磺酰胺衍生物合成及抗EGFR三重突变肺癌研究，化合物9f在细胞实验中IC50达33.3-95.3nM，小鼠模型中抑制肿瘤生长67.3%，通过抑制EGFR磷酸化及降低iNOS、COX-2、NF-κB表达实现抗炎抗肿瘤双重机制。

　　

谭振友|姚涵|彭俊|曹龙才|李行书|曾伟

广东省功能性分子工程重点实验室，华南理工大学化学与化学工程学院，广州510641，中国

摘要

开发能够克服对第三代EGFR抑制剂（如奥西美替尼）获得性耐药性的新型抗癌化合物具有重要意义。本研究设计并合成了十八种甲氧基喹唑啉磺酰胺衍生物，并使用三种EGFR三突变肿瘤细胞系评估了它们的抗肿瘤活性。其中，最优化合物9f对Baf3-L858R/C797S/T790M、Baf3-Del19/C797S/T790M和H1975-L858R/C797S/T790M癌细胞系的IC??值分别为33.3–95.3 nM，这一结果与克隆形成实验和3D球形悬浮培养实验的结果一致。在携带H1975-L858R/C797S/T790M肿瘤的小鼠体内进行的抗肿瘤实验中，化合物9f实现了67.3%的肿瘤生长抑制率。机制研究表明，9f具有优异的抗炎作用，包括在Raw264.7细胞中下调炎症相关蛋白iNOS、COX-2和NF-κB (p65)的表达（Western blot实验），在LPS刺激的Raw264.7细胞中增加NO的分泌（荧光强度实验），以及在Raw264.7和THP-1细胞中减少IL-6的分泌（ELISA实验）。此外，机制研究还表明9f能够促进肿瘤细胞凋亡并抑制关键肿瘤生长蛋白EGFR的磷酸化。

引言

癌症是一种严重威胁人类健康和生命的重大疾病。在所有高发癌症中，肺癌的恶性程度最高，全球死亡率最高[1]、[2]、[3]。2022年，全球新报告的2000万例癌症病例中，约有250万例为肺癌（占12.4%），约180万例肺癌相关死亡（占18.7%），两者均位居首位[4]。东亚是肺癌的高风险地区，约占全球新病例的50%，其中中国 alone 占全球总量的40%以上[5]。表皮生长因子受体（EGFR）是一种受体酪氨酸激酶（RTK），广泛表达于上皮细胞膜上，但不包括血管组织[6]、[7]。在正常细胞中，EGFR酪氨酸激酶通过与配体的结合被激活，在调节正常细胞的生长、增殖和其他生理功能中起关键作用。当参与这一途径的调控基因发生突变或扩增时，它们会触发由EGFR介导的下游信号通路的异常激活，从而促进各种恶性肿瘤的发展[8]、[9]、[10]。2003年，世界上首个针对EGFR突变的药物吉非替尼获准上市。作为第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），吉非替尼对携带EGFR敏感突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者表现出良好的治疗效果[11]、[12]、[13]。随后，厄洛替尼[14]、[15]和伊科替尼[16]相继问世，统称为第一代EGFR-TKIs。这些药物显著提高了EGFR敏感NSCLC患者的总生存期（OS）和生活质量（QoL）。然而，患者通常在治疗1-2年后会出现不同程度的获得性耐药性[17]。因此，第二代[18]和第三代EGFR抑制剂应运而生。其中，奥西美替尼（AZD9291）是一种典型的第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI），对由EGFR L858R/T790M突变引起的耐药性具有高效作用。临床研究表明，近一半对第一代EGFR TKIs（如吉非替尼）产生耐药性的患者在接受奥西美替尼治疗后肿瘤有所缩小，显示出优异的抗肿瘤活性[19]、[20]、[21]。然而，患者在接受第三代EGFR抑制剂治疗后也可能产生耐药性[22]、[23]、[24]。EGFR C797S突变和c-Met扩增是这些药物耐药性的主要机制[25]、[26]。基于此，探索和开发能够克服第三代EGFR TKI靶向药物耐药性的新药物具有重要意义。

2017年，Katayama R等人报告称，布吉替尼（AP26113）与EGFR单克隆抗体（如西妥昔单抗）的组合可以有效克服由EGFR C797S突变引起的奥西美替尼耐药性，并在小鼠药理学模型中显示出有希望的结果[27]。随后，发现了多种能够抑制第三代EGFR抑制剂耐药性的新活性分子[28]、[29]、[30]、[31]。然而，到目前为止，市场上还没有第四代EGFR抑制剂。因此，设计、合成和评估新型第四代EGFR抑制剂对于为新一代抗肿瘤药物的开发奠定基础具有重要意义（见图1）。（见方案1。）

近年来，研究表明肿瘤微环境的慢性炎症是肿瘤转移的关键驱动因素[32]、[33]。肿瘤中的炎症细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）等细胞因子，可以通过激活核因子κB（NF-κB）信号通路来增强肿瘤细胞的侵袭性[34]、[35]、[36]。同时，这些复杂的细胞因子成分可以增加肿瘤细胞的存活和生长潜力。例如，研究表明，PD-L1抑制剂与COX-2抑制剂塞来昔布联合使用治疗晚期黑色素瘤，中位无进展生存期（PFS）为14.2个月，比单用免疫疗法延长了5.3个月（HR = 0.64，P = 0.012）[37]。因此，鉴于癌症与炎症之间的密切关系，针对炎症-肿瘤轴的靶向治疗已成为临床研究的重点。然而，在多项结合抗炎和抗肿瘤药物的研究中，实验动物表现出毒性副作用，如肝肾损伤以及胃肠道溃疡[38]、[39]、[40]。因此，设计和合成同时具有抗炎和抗肿瘤特性的双功能分子具有显著优势。

分子中含有甲氧基的药物在体内可能通过CYP450酶系统的作用发生脱甲基化和进一步氧化成醌类物质，这一过程可能赋予它们多种药理活性，如抗炎和抗肿瘤作用[41]、[42]。此外，最新研究[43]、[44]表明，C797S突变NSCLC中的抗炎作用可以通过减少NF-κB的表达和细胞因子的分泌来增强C797S抑制剂的抗肿瘤活性。鉴于磺胺类药物具有抗菌和抗炎活性[45]、[46]，我们设计并合成了一系列含有甲氧基喹唑啉和磺酰胺结构的衍生物，这些衍生物同时具有抗肿瘤和抗炎活性。设计策略如图2所示。以布吉替尼（一种中等效力的C797S抑制剂）作为先导化合物，将甲基膦酸基团替换为烷基磺酰基团以增强与EGFR的氢键结合。然后，将嘧啶结构替换为6,7-二甲氧基喹唑啉结构，该结构可以通过代谢过程形成蒽醌产物。此外，R2和R3位点也替换了不同的取代基以改善抗肿瘤活性。基于上述策略，我们希望识别出有前景的抗肿瘤先导化合物，并为进一步研究奠定基础。

章节摘录

化学

目标化合物I的合成策略和路线如图1所示：首先，从市售的2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹唑啉1开始，在酸催化下与o-苯二胺2进行亲核取代反应，得到中间体3。然后在有机碱存在下，用磺酰氯对3进行酰化，得到关键中间体5。或者，4-氟硝基苯衍生物6与R?取代的有机胺反应生成中间体7

结论

肿瘤的发生和发展与炎症密切相关。癌前病变和肿瘤进展都表现出炎症反应的特征：免疫炎症细胞浸润、炎症介质的积累、组织结构重塑和新生血管形成。肿瘤炎症微环境主要由各种先天性和适应性免疫炎症细胞以及炎症介质（如细胞因子、趋化因子等）组成

通用方法

合成中使用的所有试剂均为市售产品，除非另有说明，否则无需进一步纯化。化学品和溶剂均为试剂级，直接从Alfa Aesar（Ward Hill, MA）和Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）购买，无需进一步纯化。¹H NMR和¹³C NMR光谱分别在Bruker BioSpin GmbH光谱仪上以400 MHz和100 MHz的频率记录，以四甲基硅烷（TMS）作为内标。高分辨率质谱（HR-MS）数据

CRediT作者贡献声明

谭振友：验证、资源、方法学、研究。姚涵：研究、数据分析、数据管理。彭俊：撰写初稿、数据分析、数据管理。曹龙才：可视化、软件应用。李行书：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。曾伟：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢NSFC（编号22271100、编号22571095）和GBABRF（编号2023A1515010070）的财政支持。