喹唑啉酮类活性分子的新靶点的鉴定及其生物活性；同时探讨光交联剂的标记偏好

《Bioorganic Chemistry》：Identification of novel target of quinazolinones active molecules and bioactivity & labeling preference of photocrosslinkers

光亲和标记-亲和蛋白谱（PAL-AfBPP）技术通过构建含不同光交联剂的多功能探针库，系统评估了光交联剂类型对喹诺酮类活性分子QDAU5生物活性和靶向蛋白选择性的影响，发现四氮唑和2-硝基苯甲醇衍生物能有效维持QDAU5的血管正常化活性及对EphrinB2和Thymosinβ4的靶向偏好性。研究为精准设计光亲和探针及解析QDAU5调控血管正常化的分子机制提供了新依据。

　　

李彦晨|刘婷婷|张坤|王瑾|张俊宇|张杰

西安交通大学健康科学中心药学院，中国西安710061

摘要

光亲和标记-基于亲和力的蛋白质分析（PAL-AfBPP）在目标蛋白质发现等多个领域提供了突破性解决方案。光亲和连接子的选择是PAL-AfBPP探针设计和应用的关键组成部分。目前，有机化学的发展也使得噻吩取代的α-酮酰胺、四唑、异噁唑、2-硝基苯甲醇等结构成为PAL-AfBPP探针设计的新候选光亲和配体。然而，不同连接子与活性分子的偶联如何影响母体化合物的生物活性、标记效率以及目标选择性仍不明确。先前的研究发现，以QDAU5为代表的活性喹唑啉酮分子具有显著的血管正常化作用，并最终确定EphrinB2是QDAU5的细胞内靶蛋白。同时，还发现胸腺素β4（Tβ4）能够被QDAU5探针有效富集，这可能是QDAU5发挥生物效应的另一种方式。在此，我们构建了一个光交联剂库和一个多功能光亲和探针库，以验证不同光交联剂对喹唑啉酮活性和标记选择性的影响。基于蛋白质组学分析，进一步验证了潜在的靶蛋白Tβ4，并初步阐明了QDAU5与Tβ4之间的相互作用机制。本研究结果为PAL-AfBPP探针设计中光交联剂的精确选择提供了实际参考，同时也为阐明活性喹唑啉酮调控血管生成和正常化的机制提供了更多支持。

引言

化学蛋白质组学已成为发现和鉴定新靶点的强大工具，主要分为基于活性的蛋白质分析（ABPP）和基于亲和力的蛋白质分析（AfBPP）[1]、[2]。其中，ABPP由于标记的蛋白质数量有限，通常使用片段状共价分子进行靶点鉴定和确认，在活性化合物的结构优化方面面临挑战[3]、[4]。相比之下，AfBPP适用于各种活性小分子的靶点鉴定，包括但不限于非共价或共价小分子、肽类、蛋白质降解剂等。与ABPP相比，AfBPP的标记范围已扩展到涵盖所有功能蛋白家族[5]、[6]、[7]。目前，AfBPP在未知靶蛋白鉴定、瞬时弱蛋白-蛋白相互作用（PPI）研究、配体-蛋白结合位点结构分析、新靶点功能发现以及新型“非专利”靶点发现等领域展现出前所未有的前景[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。

基于PAL-AfBPP的化学蛋白质组学的核心在于开发保持生物活性的多功能光亲和探针[13]。根据先前对活性分子的结构-活性关系分析，确定了衍生化位点，并通过引入光亲和配体构建了具有母体分子活性的新型多功能光亲和探针，从而保留了探针的靶点结合特性[14]。一方面，引入生物正交功能基团可以分步完成靶蛋白的鉴定和纯化标记的引入，克服了传统纯化标记对活性分子的影响；另一方面，通过生物正交反应引入报告标签可以实现靶蛋白的亚细胞定位成像，进一步提高靶蛋白鉴定的准确性（图1）[15]、[16]。

光交联剂是AfBPP的另一个关键组成部分。通常在构建多功能光亲和探针时使用芳基叠氮化物、苯甲酮和二氮杂环丙烷，其中二氮杂环丙烷由于在紫外照射下生成的中间体体积小且反应性强，在AfBPP应用中具有显著优势[17]、[18]、[19]。此外，随着有机化学和药物化学的不断探索，发现了噻吩取代的α-酮酰胺、四唑、异噁唑、2-硝基苯甲醇等结构，这些结构在紫外照射下也能生成活性中间体并与附近的蛋白质靶点发生共价交联。目前，这些结构已成功用于构建模型PAL-AfBPP探针和模型靶点鉴定研究，成为光交联剂的候选分子[20]、[21]、[22]、[23]。然而，不同结构与活性分子的偶联对生物活性、标记效率及母体分子选择性的影响仍不甚清楚。因此，准确高效地选择光交联剂对于在复杂系统中可靠发现潜在靶点至关重要。

在肿瘤过程中，由血管异常引起的肿瘤药物耐药性已成为抗血管生成治疗的瓶颈，而血管正常化理论为此提供了突破性解决方案[24]、[25]。在之前的研究中，通过对水杨醛肟类先导化合物的系统结构优化，发现以QDAU5为代表的喹唑啉酮分子具有显著的血管正常化作用，并与EphrinB2发生强烈相互作用。由此确认EphrinB2是血管正常化的新靶点。同时，蛋白质组学研究意外发现胸腺素β4（Tβ4）也能被QDAU5探针有效富集，可能是另一种血管正常化的潜在靶点[26]、[27]。在此，我们基于喹唑啉酮活性分子QDAU5构建了一个光交联剂库和一个多功能光亲和探针库，以确认Tβ4作为新的血管正常化靶点，并模拟探针-靶蛋白相互作用。阐明了光交联剂多样性对生物活性、标记效率及母体分子选择性的影响，进一步揭示了喹唑啉酮的血管正常化机制。

章节片段

化学

目标化合物的设计与合成包括构建光交联剂库以及基于喹唑啉酮活性分子QDAU5的多功能光亲和探针的合成。库中设计了并合成了六种光交联剂，包括二氮杂环丙烷、噻吩取代的α-酮酰胺、四唑和2-硝基苯甲醇。为确保探针与活性分子具有相同的靶点，进行了初步的结构-活性关系分析

结论

在本研究中，我们成功构建了一个光交联剂库和一个多功能光亲和探针库。利用这些资源，系统评估了各种光交联剂对母体喹唑啉酮骨架的体外抗肿瘤和抗血管生成活性的影响，以及它们对EphrinB2靶蛋白标记选择性的影响。结果表明，体积小、空间位阻低的交联剂具有较好的效果

化学

详细信息请参见补充材料。

凋亡

使用Annexin V-FITC/PI双染方法。细胞均匀接种在6孔板中培养过夜，按照相应的实验方案进行处理。培养48小时后，保留培养基，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，与之前的培养基混合后转移到Ep管中，再用预冷的PBS洗涤3次。染色过程中加入100 μL稀释的染料

CRediT作者贡献声明

李彦晨：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化，验证，资源，方法学，研究。刘婷婷：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化，验证，方法学，研究。张坤：撰写 – 初稿，方法学，研究。王瑾：撰写 – 初稿，监督，方法学，研究。张俊宇：方法学，研究。张杰：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：82373793和823B2096）、陕西省重点研发计划（项目编号：2024CY-JJQ-40）、陕西省自然科学基础研究计划（项目编号：2024JC-YBMS-713）、陕西省中医药管理局中医药研究创新团队（项目编号：2025-CXTD-05）以及中央高校基本科研业务费（项目编号：xtr062025005）的支持。我们感谢...