基于香豆素的乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究进展：合成、生物活性评估与计算模拟

《Bioorganic Chemistry》：Development of coumarin-based acetylcholinesterase inhibitors: Synthesis, biological assessment and computational simulations

阿尔茨海默病新型6-氨基coumarin衍生物（5、6a-c、10a-j）合成及多靶点活性研究，显示化合物10f对AChE（IC50=3nM）、BuChE（IC50=303nM）及GSK-3β（IC50=7.58nM）具有显著抑制活性，分子对接和动态模拟证实其高亲和力与稳定性，为多模式治疗提供候选分子。

　　

Nouran E. Emam | Rana H. Refaey | Mohamed K. El-Ashrey | Walaa R. Mahmoud | Yassin M. Nissan | Emad M. Seif

药学院药理化学系，埃及吉萨现代科学与艺术大学（MSA）

摘要

我们设计、合成并评估了新型基于香豆素的衍生物（5、6a-c 和 10a-j），这些衍生物具有多模式抗阿尔茨海默病活性，能够靶向乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BuChE）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）。合成出的衍生物产率良好，其结构通过光谱分析得到了确认。在这些衍生物中，四种衍生物（10c、10d、10f 和 10i）在纳摩尔浓度下对乙酰胆碱酯酶表现出显著的抑制活性（IC₅₀ 分别为 5.93 ± 0.06、3.97 ± 0.15、3 ± 0.1 和 4.97 ± 0.06 nM），超过了参考药物多奈哌齐（IC₅₀ = 7.03 ± 0.15 nM）。此外，衍生物 10f 对丁酰胆碱酯酶的抑制活性也很显著（IC₅₀ = 303 ± 0.03 nM），约为多奈哌齐活性的两倍。因此，选择 10f 进行 GSK-3β 抑制实验，其抑制活性在纳摩尔范围内也高于广谱激酶抑制剂星孢素（IC₅₀ = 8.63 ± 0.94 nM）。另外，还测试了 10f 的螯合铁的能力，结果显示其活性优于常用的螯合剂 EDTA。通过将 10c、10d、10f 和 10i 与乙酰胆碱酯酶（PDB: 4EY7）进行分子对接分析，发现 10f 是一个有前途的候选化合物，因为它具有良好的相互作用和高亲和力。关键的氢键、疏水相互作用以及 π–π 堆叠作用支持了其生物活性。分子动力学模拟表明化合物-酶复合物的稳定性良好，RMSD 波动小，结合自由能有利。总体而言，10f 是一种具有多模式活性的阿尔茨海默病治疗候选化合物。

引言

阿尔茨海默病（AD）是最常见且进展最快的痴呆症类型，约占痴呆病例的 60–70% [1]，[2]。目前约有 720 万 65 岁及以上的美国人患有阿尔茨海默病，到 2060 年这一数字可能增长到 1380 万 [3]。全球范围内，有 5740 万人患有痴呆症，预计到 2050 年这一数字将超过 1.53 亿。这种神经退行性疾病的发病率正在迅速上升，成为全球主要的健康问题。阿尔茨海默病会导致记忆、注意力、语言和判断等基本认知能力的下降。目前尚无法阻止或逆转这一进程。寻找有效的治疗方法对于数百万患者来说至关重要，同时应尽量减少副作用。阿尔茨海默病的特点是乙酰胆碱酯酶（AChE）水平升高，导致乙酰胆碱（ACh）和多巴胺失衡，以及 ACh 水平显著下降。该疾病还表现为 β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和神经纤维缠结（NFTs）的积累，这两种现象都与糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的过度表达密切相关 [4]，[5]。Aβ 斑块的积累是由淀粉样前体蛋白（APP）的异常切割引起的 [6]，[7]。乙酰胆碱在学习和记忆等大多数认知功能中起着关键作用 [8]。根据胆碱能假说，胆碱能神经元的退化会降低大脑某些区域（如海马体和皮质）中 ACh 的生物活性，这被认为是阿尔茨海默病的标志性症状（包括记忆障碍和认知能力下降）的原因 [9]，[10]。阿尔茨海默病的治疗旨在缓解症状，以提高患者的生活质量并减缓认知能力的衰退 [11]。现有的治疗策略根据认知障碍的轻重程度（轻度、中度或重度）而有所不同，包括使用乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEIs）。ACh 神经递质在神经肌肉接头和胆碱能脑突触处被两种丝氨酸水解酶 AChE 和 BuChE 分解为胆碱和乙酸 [12]。释放出的胆碱可以被突触前神经元中的胆碱载体吸收，并在胆碱乙酰转移酶的作用下与乙酰辅酶 A（Acetyl CoA）结合，从而再生 ACh [13]。BuChE 在 Aβ 斑块和神经纤维缠结中浓度较高，这表明它可能参与了斑块的形成 [12]。尽管 AChE 和 BuChE 的晶体结构非常相似，但它们与抑制剂的结合具有高度特异性和敏感性。AChE 的水解潜力是 BuChE 的 10 到 13 倍，因此 AChE 抑制剂是目前临床用于治疗阿尔茨海默病的唯一药物，例如 NMDA 受体拮抗剂美金刚。使用抗淀粉样抗体作为治疗策略也是一种新方法，该方法具有多种优势，如靶向作用机制、疾病修饰潜力和生物标志物验证。然而，这种方法也存在一些缺点，如临床效果不一、安全性问题、成本高昂以及适用患者群体有限 [14]。尽管抗淀粉样抗体具有巨大潜力，但开发新的小分子药物仍然至关重要，原因包括：更全面的机制、更好的渗透性和剂量控制以及联合治疗的可能性 [15]。随着阿尔茨海默病的发展，BuChE 的活性增加而 AChE 的活性下降，这使得中枢神经系统中的 BuChE 成为与 AChE 同样重要的治疗靶点 [16]。AChE 有两个主要结合位点：催化阴离子位点（CAS），负责水解乙酰胆碱，包含 Ser200、His440 和 Glu327；以及周围阴离子位点（PAS），有助于稳定底物结合，包含 Tyr70、Tyr121、Trp279、Trp286、Tyr72、Tyr124 和 Asp74 等芳香族残基 [17]，[18]。目前用于阿尔茨海默病治疗的主要策略是开发乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEIs），以增加 ACh 水平，例如 FDA 批准的多奈哌齐、利凡斯的明和加兰他敏，这些药物可用于阿尔茨海默病的早期至中期 [19]。多奈哌齐可逆且选择性地结合 AChE，从而防止 ACh 的水解，增加突触处的 ACh 含量 [20]。多奈哌齐被证明是一种双结合位点抑制剂，同时作用于催化活性位点（CAS）和周围阴离子位点（PAS）[21]。与其他 AChEIs 相比，多奈哌齐能以较低的副作用改善认知功能 [22]。香豆素具有广泛的生物活性，如抗炎、抗凝血、抗癌、抗氧化、降压、抗病毒、抗真菌、抗细菌、抗高血糖和抗惊厥作用 [23]，[24]，[25]，[26]，[27]。有趣的是，香豆素通过抑制 AChE 的 CAS 和 PAS 位点以及抑制 Aβ 聚合，显示出良好的抗阿尔茨海默病效果 [28]。在这些香豆素衍生物中，天然化合物 esculetin、scopoletin 和合成改造的 enasculin 可通过防止乙酰胆碱分解来发挥抗阿尔茨海默病作用 [29]，[30]，[31]，[32]，[33]，[34]，[35]。

此外，已有研究表明芳香胺衍生物 Ia 和 Ib 对 AChE 的抑制活性很强，IC₅₀ 分别为 41 和 56.9 nM，优于多奈哌齐（IC₅₀ = 59 nM）。取代的 6-氨基香豆素和乙酰胺基香豆素衍生物 IIa、IIb 和 III（IC₅₀ 分别为 55、37 和 55.2 nM）也显示出良好的抑制活性 [36]（见图 2）。

因此，这些香豆素可以通过芳香 π-π 堆叠作用与 AChE 的 PAS 结合。将香豆素与多种胺类结合可以扩展其与 CAS 的双重结合能力，同时酰胺的羰基部分对于氢键结合或与生物靶标的亲核攻击等相互作用至关重要 [13]。

基于此，我们的研究旨在发现具有强效 AChE 抑制活性的新型 6-氨基香豆素衍生物，同时保留必要的药效团特征，以支持多靶点定向配体（MTDL）的作用。这些衍生物具有平面杂芳香核心，可靶向 CAS，同时带有连接到 PAS 的疏水尾部，以及用于螯合生物金属的碱性氮原子。设计的分子能够抑制胆碱酯酶，防止 Aβ 聚积，并减轻与阿尔茨海默病相关的氧化应激 [38]。因此，建议 6-氨基香豆素骨架与 p-取代的-2-苯氧基-N-苯基酰胺衍生物通过席夫碱（10a-j）结合。此外，6-氨基香豆素还可以通过酰基间隔基团与二级芳香胺（见图 3）结合。合成的衍生物经过生物活性评估，其中最有效的衍生物进一步进行了 BuChE、GSK-3β 和 Fe²⁺ 螯合能力的测试。使用 计算机模拟（in silico）和分子动力学研究进一步研究了这些化合物的结合特性。

化学

如方案 1 和方案 2 所示，制备了一系列新的 6-氨基香豆素衍生物。方案 1 描述了化合物 5 和 6a-c 的合成途径。在方案中，2-氯-N-(2-氧-2H-chromen-6-yl)propanamide 衍生物 4b 与哌啶 reflux 反应生成化合物 5。适当的 2-氯-N-(2-氧-2H-chromen-6-yl)酰胺衍生物（4a 或 4b）与相应的苯哌嗪衍生物 reflux 反应生成 6a-c [36]。

结论

本研究成功合成了 14 种新型 6-氨基香豆素衍生物（5、6a-c 和 10a-j），并通过红外光谱（IR）、¹HNMR 和 ¹³CNMR 进行了结构表征。通过 体外 实验评估了这些化合物的抗阿尔茨海默病活性。在测试的化合物中，10f 显示出与参考药物多奈哌齐相当的双重抑制活性（IC?? = 3 nM，针对 AChE 和 BuChE）。

所有化学品和溶剂均从商业供应商处购买，未经纯化直接使用。

反应通过分析型薄层色谱（TLC，Merck，德国）进行监测，斑点在 λ 254 nm 的紫外光下可见。所有试剂和溶剂均通过标准方法在二氯甲烷/甲醇或二氯甲烷中纯化并干燥，然后用该溶剂进行洗脱和可视化。熔点测量使用 Stuart 熔点仪进行。

CRediT 作者贡献声明

Nouran E. Emam：撰写初稿、方法学设计、数据整理。

Rana H. Refaey：撰写、审稿与编辑、软件应用、方法学设计、概念构思。

Mohamed K. El-Ashrey：撰写、审稿与编辑、监督、软件应用、方法学设计、数据整理。

Walaa R. Mahmoud：撰写、审稿与编辑、监督、方法学设计、数据整理、概念构思。

Yassin M. Nissan：撰写、审稿与编辑、监督、方法学设计、数据整理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。