《Bioresource Technology》：Development of a bioprocess with
Streptomyces setonensis to produce a novel herbicidal sugar as an alternative to glyphosate
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本研究致力于应对全球广泛使用的除草剂草甘膦所带来的环境与健康争议，以及杂草抗性日益严重的问题。研究人员以链霉菌为生物催化剂，系统优化了培养基成分、渗透压、磷酸盐浓度及工艺参数，成功开发并规模化了一个生产新型除草候选物质7-脱氧-景天庚酮糖（7dSh）的生物工艺，最终将其产量提升了200倍，为可持续农业除草剂的发展奠定了坚实的技术基础。
随着全球人口不断增长，保障粮食安全成为一项日益严峻的挑战。在农业生产中，杂草是威胁农作物产量的主要因素之一。为了有效控制杂草，提高作物产量，化学除草剂在全球范围内被广泛使用。其中，草甘膦（Glyphosate）是全球用量最大的除草剂。然而，其长期和大量使用带来了一系列令人担忧的问题：草甘膦及其降解产物在土壤、水体乃至食物链中被频繁检出，对昆虫、水生生物乃至人体健康都可能构成潜在风险。与此同时，长期单一使用草甘膦等除草剂，导致越来越多的杂草生物型产生了抗药性。这使得农业生产陷入了一个恶性循环——为了维持除草效果，可能需要使用更多的药剂或更复杂的组合，但这又进一步加剧了环境负担和抗性风险。因此，寻找一种高效、生态友好且作用机理新颖的除草剂替代品，已成为农业和环境科学领域迫在眉睫的需求。
正是在这样的背景下，一种名为7-脱氧-景天庚酮糖（7-deoxy-sedoheptulose，简称7dSh）的天然化合物进入了研究人员的视野。7dSh是一种糖类分子，最初从聚球藻的发酵液中被分离出来，被发现能选择性地抑制蓝藻和植物的生长。其作用机制与草甘膦类似，都靶向植物和微生物中普遍存在、而动物体内没有的莽草酸途径（Shikimate pathway），从而干扰芳香族氨基酸的合成。重要的是，初步研究显示，7dSh对斑马鱼胚胎发育和人类细胞系未显示出明显的细胞毒性，表明其可能具有更高的环境安全性。然而，要将7dSh开发成一种可行的商业除草剂，首先必须解决其规模化生产的问题。此前，无论是通过化学酶法合成，还是利用聚球藻等微生物生产，7dSh的产量都极低，成本高昂，无法满足实际应用的需求。
幸运的是，研究人员发现了一种名为Streptomyces setonensis（赛托链霉菌）的天然菌株，它能天然产生一种与7dSh相同的化合物（曾被称为SF-666）。与聚球藻相比，该菌株的初始产量就高出16倍，显示出作为工业化生产菌株的巨大潜力。但是，关于S. setonensis的基础研究和发酵工艺开发此前几乎是一片空白。为了将这一科学发现转化为实际应用，来自德国比勒费尔德应用科学与艺术大学的研究团队X. Steurer、B. Kalik、D. Jakobs-Sch?nwandt、A. Grünberger和A.V. Patel在《Bioresource Technology》期刊上发表了一项突破性研究。他们首次为S. setonensis开发了一个完整的生物工艺，用于高效生产7dSh，并成功实现了从摇瓶到15升发酵罐的工艺放大，最终将7dSh的产量提升了惊人的200倍。
为了开展这项研究，研究人员运用了一系列关键的生物工艺开发技术。他们首先利用实验设计（Design of Experiments， DOE）方法在摇瓶水平筛选了影响菌体生长和7dSh生产的关键因素，如培养基成分、渗透压、装液量和摇床转速。为了深入理解菌体的代谢活动，他们使用了高通量微生物反应器系统（BioLector Pro）进行平行培养与在线监测，并采用了呼吸活性监测系统（Respiration Activity MOnitoring System， RAMOS）实时测量氧气传质速率（OTR），以识别菌体的生长阶段和可能的营养限制。在优化了关键参数后，研究团队基于恒定的体积功率输入（P/V）原则，成功地将工艺从250毫升摇瓶规模放大到2升搅拌式发酵罐，并最终放大到15升发酵罐。在发酵罐中，他们实施了pH控制和补料分批（Fed-batch）培养策略，以延长菌体的生产期并提高最终产量。
研究结果
3.1. 实验设计用于识别有利的工艺条件
通过实验设计方法，研究人员系统评估了碳源（葡萄糖）、氮源（硫酸铵）、渗透压（通过NaCl调节）、装液量和摇床转速五个关键因素对7dSh产量的影响。统计分析结果显示，所有五个因素都对产量有显著影响。其中，提高渗透压和增加葡萄糖浓度被证明对提高7dSh产量最为有利，而高浓度的氮源则显示出轻微的负面影响。较低的摇床转速和中等装液量组合有利于产量，这被认为是避免了剪切力对链霉菌丝状形态的损害。通过优化参数组合，在摇瓶水平将7dSh产量从文献报道的22 mg/L大幅提升至2.02 g/L，实现了近100倍的初步增产。
3.2. 小规模工艺参数研究
为深入理解代谢和验证氧气可用性的影响，研究人员使用RAMOS系统监测了氧气传质速率。他们发现，在实验涉及的装液量范围内，菌体并未出现明显的氧气限制，这表明其生长相对缓慢。研究重点考察了磷酸盐浓度的影响。当提高培养基中磷酸盐浓度时，菌体的代谢发生了显著改变：生长速率略有降低，但在达到最大OTR后，菌体进入了一个延长的平台期，而非迅速衰亡。在这个平台期内，7dSh的合成速率显著提高。同时，提高磷酸盐浓度有助于稳定发酵液的pH值。研究还证实，提高渗透压（通过增加NaCl浓度）能独立且显著地提高7dSh产量。综合来看，高磷酸盐和高渗透压的组合通过稳定细胞代谢、延长生产期，共同促进了7dSh的高产。
3.3. 摇瓶中工艺模式的研究
基于上述发现，即7dSh的生产似乎与菌体生长非直接关联（非生长关联型），且高磷酸盐条件能延长高产期，研究人员开始探索补料分批培养策略。在摇瓶中进行葡萄糖补料实验，结果显示，持续的葡萄糖供给能够将OTR维持在平台期，从而显著延长7dSh的生产阶段。相比之下，磷酸盐限制条件则导致菌体快速衰亡，无法从补料中受益。此外，尝试补充氮源并未进一步促进产量，表明在该优化体系中氮源并非限制性因素。这些结果清晰地表明，在优化的高磷酸盐和高渗透压条件下，实施葡萄糖补料策略是延长生产期、进一步提高7dSh产量的有效途径。
3.4. 搅拌罐生物反应器的工艺放大与优化
研究人员将摇瓶中优化的条件（高葡萄糖、高磷酸盐、高NaCl）成功放大到2升搅拌罐反应器中。他们首先比较了分批、重复分批和补料分批三种操作模式。结果表明，补料分批模式显著优于其他模式。在补料分批过程中，通过持续补充浓缩的葡萄糖溶液，维持了菌体的代谢活性，并将7dSh的产量进一步提升至3-4 g/L。这一成功验证了小规模实验的结论。在此基础上，团队进一步将工艺放大到15升反应器。他们根据恒定体积功率输入的放大准则，计算并调整了搅拌转速等参数。在15升规模上，补料分批工艺运行稳定，最终成功生产出超过4 g/L的7dSh，这代表了目前文献报道的最高产量，并且为未来中试乃至大规模生产奠定了坚实的技术基础。
结论与意义
本研究首次为Streptomyces setonensis菌株系统开发并优化了一个生产新型除草剂候选分子7dSh的高效生物工艺。通过综合运用实验设计、高通量筛选、在线代谢监测和理性的工艺放大策略，研究人员成功识别出高渗透压和高磷酸盐浓度是驱动7dSh高效合成的关键环境因素。这些条件不仅直接刺激了产量，更重要的是改变了菌体的代谢模式，使其在生长后期进入一个延长的、高产的生产阶段。基于这一认识，研究所开发的葡萄糖补料分批策略有效延长了这一生产期，从而在搅拌罐生物反应器中将7dSh的产量从起始的22 mg/L提升至超过4 g/L，实现了200倍的巨大飞跃，并成功完成了向15升规模的工艺放大。
这项工作的意义是多方面的。首先，在科学层面，它深入揭示了环境压力（如渗透压和磷酸盐水平）如何调控链霉菌次级代谢产物的合成，为理解这类重要工业微生物的生理和代谢调控提供了新的见解。其次，在技术层面，它展示了一套从菌株筛选、工艺开发到规模放大的完整且高效的生物工艺研发流程，可作为类似微生物产品开发的范本。最后，也是最重要的，在应用层面，这项工作为7dSh作为一种潜在的安全、可持续的草甘膦替代除草剂走向实际应用扫除了关键的生产障碍。所达到的克级每升的产量，使得下游的制剂研究、田间试验和最终的商业化成为可能。在全球致力于发展绿色农业和减少化学农药对环境影响的今天，这项研究为实现这一目标贡献了一个极具前景的技术解决方案。
