《Biosensors and Bioelectronics》：Dual-Readout Aptasensor based on CRISPR/Cas12a and Nanozyme for Accurate Detection of KIM-1 and Its Application in Kidney Transplant Prognosis
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KIM-1检测新方法融合aptamer、CRISPR/Cas12a及纳米酶实现高灵敏双信号输出，成功追踪肾移植术后尿液KIM-1动态变化。
赵丽萍|刘卓婷|丁光普|朱一晨|王浩|刘瑞雪|曲峰|敖强国|朱先宇|张洋|杨戈|王振昌
北京友谊医院精准与智能医学影像实验室，首都医科大学，北京，100050，中国
摘要
肾损伤分子-1（KIM-1）已成为评估肾移植功能的关键生物标志物。然而，由于其灵敏度和准确性的限制，其检测仍具有挑战性。本文提出了一种创新的生物传感平台，该平台结合了适配体识别、CRISPR切割和纳米酶扩增技术，实现KIM-1的双重读数检测。该平台使用经过精心选择的高亲和力适配体通过毛细管电泳SELEX技术进行特异性目标识别，利用CRISPR/Cas12a系统进行信号转导和级联扩增，并采用工程化的FeNi MOF@AgNPs纳米酶实现双重信号输出。当存在KIM-1时，其与适配体的结合会有效抑制CRISPR/Cas12a系统的切割活性，未被抑制的Cas12a随后会切割纳米酶偶联的磁性探针，释放出FeNi MOF@AgNPs纳米酶，这些纳米酶催化TMB反应产生强烈的比色和荧光双重读数信号。所开发的适配体传感器表现出令人满意的灵敏度，检测限分别为58.7 pg/mL（比色法）和34.4 pg/mL（荧光法），并且在急性肾损伤患者的尿液样本中与商用ELISA试剂盒相比，具有平均相对偏差分别为-2.7%（比色法）和3.2%（荧光法）。此外，还成功实现了对肾移植后前8天内尿液中KIM-1浓度动态变化的纵向追踪。这项工作不仅为KIM-1的检测提供了强大的分析工具，还为扩展基于CRISPR的系统以精确检测蛋白质建立了一种通用研究方法。
引言
肾移植是治疗终末期肾病患者最有效的方法。然而，移植后早期移植物功能恢复和长期生存仍然是临床实践中的核心问题（Nishio Lucar等人，2024年）。移植物功能延迟（DGF）尤其是急性排斥反应是影响预后的关键因素，其管理依赖于对 tubular 损伤的及时识别和干预（Tabernero等人，2023年；Yarlagadda等人，2009年）。肾损伤分子-1（KIM-1）是一种跨膜蛋白，在受损的近端小管中特异性上调并释放到尿液中，已成为评估肾损伤和修复过程的潜在生物标志物（Van Timmeren等人，2007年；Zhang等人，2008年）。与血清肌酐等传统标志物相比，尿液中KIM-1浓度的变化能更早、更直接地反映小管压力，为临床决策提供了关键的治疗窗口（Aldea等人，2025年；Zhang和Pafikh，2019年）。然而，由于缺乏合适的检测方法，其集成到常规诊断中受到了阻碍（Cai等人，2019年；Jackcy等人，2020年）。尽管已经采用了多种传统技术（包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）、电化学方法和表面等离子共振（SPR）来检测KIM-1），但这些方法存在一些局限性，如检测时间较长、需要复杂且昂贵的光学仪器，以及对低分子量蛋白质的灵敏度较低（Das等人，2023年；Seitkamal等人，2025年）。因此，开发一种结合高灵敏度、高特异性和操作简便性的新型KIM-1检测策略对于优化移植后管理和改善患者预后具有重要意义。
近年来，包含规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白的CRISPR/Cas系统作为一种强大的信号放大工具而脱颖而出，因为它具有出色的目标基因识别能力。利用其DNase/RNase活性，该系统已在传感和检测领域得到广泛应用（Zhu等人，2023年）。特别是Class 2 CRISPR系统（包括Cas12、Cas13和Cas14a）已成为下一代分子诊断的关键工具（Li等人，2022a；Sun等人，2023年）。这些系统中crRNA的可编程特性使得能够精确识别和切割顺式和反式目标DNA或RNA，从而便于在光学检测方法中实现信号读出，并实现高灵敏度的目标识别。在Class 2 CRISPR系统中，Cas12a蛋白因其更简单的crRNA设计、更高的特异性和更广泛的应用性而被广泛用于核酸生物传感（Liu等人，2024年）。然而，与非核酸目标的检测相比，这一领域仍处于早期阶段，并面临多重挑战。适配体是通过指数富集（SELEX）技术系统进化选择的单链寡核苷酸，它们表现出与抗体相当的高特异性和亲和力，同时具有易于化学合成和修饰、可编程的序列和结构、低毒性和免疫原性以及高化学稳定性，使其成为生物传感应用的理想识别元件（Zhao等人，2021年）。通过作为识别和转导元件，适配体与目标的结合事件可以直接转化为CRISPR-Cas介导的切割作用在报告探针上，从而反映目标的浓度变化。基于这一原理，已经开发出基于CRISPR/Cas的通用适配体传感器，能够高效灵敏地检测各种非核酸分析物（Geng等人，2025年；Zhao等人，2024年；Zhang等人，2024年；Zhu等人，2024年）。在基于CRISPR/Cas的适配体传感器中，常用的信号探针是荧光团-淬灭剂标记的单链DNA，通过这种方式，目标信号可以转化为实时、高灵敏度的荧光信号。为了扩展这些适配体传感器在多种应用场景中的适用性，研究人员基于不同的信号读出模式开发了各种报告探针，如SERS探针（Li等人，2022b；Zhuang等人，2022年）、基于个人血糖仪的探针（Chen等人，2023年）和电化学探针（Han等人，2022年；Xu等人，2025年）。
纳米酶通常被定义为具有内在酶样特性的纳米材料，由于其出色的稳定性、高催化效率和易于功能化，在生物传感器的开发中得到了广泛应用（Hong等人，2024年；Liang等人，2019年）。Broto及其同事提出了一种基于CRISPR Cas与纳米酶连接的检测方法，用于无需扩增的非编码RNA检测（Broto等人，2022年），其中设计良好的纳米酶作为信号催化剂，提高了Cas介导检测的灵敏度，消除了对前端扩增的需求。这种方法称为CRISPR-Zyme，由于其简单性和直接可视化读数特性，为即时检测提供了可行的解决方案。因此，纳米酶被证明是通过催化底物转化生成可检测信号的有希望的候选者。在此基础上，Hou的研究小组将具有高过氧化物酶活性的Fe-N-C单原子纳米酶与CRISPR/Cas12a系统结合，开发出一种高灵敏度和特异性的比色适配体传感器，用于检测黄曲霉素B1（Liu等人，2024年）。尽管获得了令人满意的检测结果，但主要依赖于单一信号输出模式，尤其是比色模式。比色方法简单易用，但其相对较低的灵敏度以及易受样品基质干扰和主观解释的影响，对其在复杂生物样本中定量微量蛋白质的准确性和可靠性构成了挑战。因此，为了扩大CRISPR-nano酶系统的应用范围，需要朝着开发双重或多重信号输出策略的方向进行战略转变。这种具有内部自验证能力和强大抗干扰性能的先进设计对于提高该方法的整体稳健性和发挥其全部临床潜力至关重要。
因此，本文提出了一种新的双重读数检测系统，用于高效准确地定量KIM-1，该系统利用适配体、CRISPR Cas12a系统和FeNi MOF@AgNPs纳米酶的协同作用（图1）。通过毛细管电泳（CE）SELEX和系统截短获得了高亲和力和高特异性的KIM-1适配体。同时合成了具有高过氧化物酶活性的FeNi MOF@AgNPs纳米酶，并对其催化机制进行了彻底研究。这种适配体被巧妙设计为CRISPR/Cas12a系统的分子开关：KIM-1与适配体的结合有效抑制了Cas12a/crRNA复合物的切割活性，随后未被抑制的Cas12a会切割特制的底物探针（FeNi MOF@AgNPs-MBs）。经过磁分离后，释放的FeNi MOF@AgNPs纳米酶可以产生两种不同的信号：比色信号来自纳米酶的POD样催化活性，在H2O2存在下氧化TMB，导致吸光度变化；荧光信号则是通过用NaOH处理纳米酶使其NH2-BDC脱质子化而产生的（Li等人，2023年；Lv等人，2018年）。所开发的适配体传感器表现出优异的准确性、选择性和灵敏度，并成功应用于术后八天内动态追踪肾移植受者的尿液KIM-1水平。这项研究不仅为KIM-1的检测提供了强大的工具，还为将基于CRISPR的方法扩展到精确检测蛋白质建立了通用策略。
材料与方法
完整实验部分的详细信息见支持信息文件第1节。补充实验。
通过CE-SELEX选择KIM-1适配体
KIM-1适配体的选择是通过结合环境压力和反向选择的CE-SELEX进行的（图1A），选择过程如图1B所示。在第一轮中，KIM-1在缓冲条件下作为初始选择的目标。这一步骤旨在获得对KIM-1具有基本结合亲和力的初级寡核苷酸序列，从而确保选择过程的有效性。得益于CE的高分离效率，
结论
本研究成功建立了一种基于适配体、CRISPR/Cas12a系统和MOF纳米酶的双重读数生物传感平台，用于高度敏感和特异性的KIM-1检测。首次通过CE-SELEX选择了对KIM-1具有高结合亲和力的抗基质效应适配体。同时构建了具有优异POD样活性和内在荧光特性的FeNi MOF@AgNPs纳米酶，并对其催化机制进行了全面阐述。
CRediT作者贡献声明
张洋：撰写 – 审稿与编辑。敖强国：撰写 – 审稿与编辑。朱先宇：撰写 – 审稿与编辑。刘瑞雪：撰写 – 审稿与编辑。曲峰：撰写 – 审稿与编辑。朱一晨：撰写 – 审稿与编辑。王浩：撰写 – 审稿与编辑。刘卓婷：撰写 – 初稿，研究。丁光普：撰写 – 初稿。杨戈：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。王振昌：撰写 – 审稿与编辑。赵丽萍：撰写 –
未引用参考文献
Liang和Yan，2019年；Lv等人，2018年；Zhang和Parikh，2019年；Zhu和Zhao，2024年。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
所有作者都对手稿做出了贡献，并批准了最终版本。本工作得到了首都医科大学北京友谊医院种子项目（YYZZ202452）、国家重点研发计划（2023YFC3605500）和CAMS医学科学创新基金（CIFMS）（2025-I2M-XHXX-105）的支持。
