《Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences》：eDNA metabarcoding provides biodiversity estimates comparable to conventional sampling methods
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为有效评估鱼类群落组成，研究人员以加拿大汉密尔顿市14个池塘为对象，系统比较了环境DNA(eDNA)宏条形码技术与传统采样方法（电捕鱼、围网捕捞）的效能，并通过排干部分池塘获得种群绝对数量作为验证标准。研究发现，eDNA在物种检测数量上与常规方法无显著差异，且在极低丰度物种检测上更具优势，但存在一定的假阳性风险。估算表明，在此类生态系统中约需11个eDNA样本即可有效量化鱼类群落生物多样性。该研究证实eDNA可作为传统方法的可行替代或补充，为增强水生生态系统管理提供了有力支持。
在全球淡水资源面临前所未有的人为压力和生物多样性衰退的背景下，准确、及时地掌握物种种群信息对于保护和有效管理水生生态系统至关重要。然而，传统的鱼类生物多样性调查方法，如电捕鱼和围网捕捞，存在一些固有局限：它们不仅具有物理侵入性，可能对鱼类个体造成伤害甚至死亡，还存在选择性偏差——网具的网目大小和在水体中的放置位置可能导致其只捕获特定大小或特定栖息地的鱼类，而电捕鱼的电压则可能对不同物种和体型的鱼类产生不同的效果。此外，这些方法通常劳动密集、资源消耗大。环境DNA(eDNA)分析技术作为一种快速、经济的水生生态系统生物多样性量化方法应运而生。它通过检测生物体脱落在环境中的DNA来识别物种，理论上具有更高的灵敏度，特别是在检测低丰度物种和难以采样的环境中的物种方面具有优势。但是，eDNA作为一种间接检测方法，其结果的有效性如何与传统“眼见为实”的物理捕获方法相媲美，一直是一个需要实证检验的关键问题。为了直接回答这个问题，Ian S. Smith及其研究团队在《Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences》上发表了一项重要研究，系统地比较了eDNA宏条形码技术与多种传统鱼类采样方法在评估淡水鱼类生物多样性方面的表现。
本研究运用的几个关键技术方法包括：1）系统性的采样设计：在加拿大安大略省汉密尔顿市的14个雨水管理池塘中，采用基于网格的系统性方法采集eDNA水样，并同步使用电捕鱼和/或围网捕捞进行传统调查。2）绝对数量验证队列：选择其中6个池塘进行排干处理，以获取鱼类的完整种群普查数据，作为衡量其他方法假阳性和假阴性率的“金标准”。3）双标记eDNA宏条形码技术：使用两套通用引物（靶向线粒体12S基因的M-Mito和靶向线粒体CO1基因的PS1）对eDNA进行扩增和高通量测序，以增强物种覆盖率和分辨率。4）生物信息学与严格过滤：使用QIIME 2等工具处理测序数据，并设定了高、低两种严格度的过滤标准（例如，“高严格度”要求物种在两个标记上均有≥10条读数）来解读eDNA检测结果，以平衡假阳性和假阴性风险。
研究结果
常规采样
通过电捕鱼、围网捕捞和池塘排干，在所有采样事件中共识别出21种鱼类。
调查方法对物种检测的影响
基于排干池塘（“金标准”）的数据分析显示，eDNA方法在假阴性方面表现优于传统方法。低严格度和高严格度eDNA分别仅漏检1种和2种物种，而电捕鱼漏检3种，围网捕捞漏检4种。所有漏检物种在排干后的普查中均仅发现1-2个个体，表明eDNA在检测极低丰度物种方面更具优势。
然而，eDNA更易出现假阳性。相对于排干普查，低严格度和高严格度eDNA分别出现了20次和8次假阳性检测，而传统方法仅出现1次。提高数据解读的严格度能显著降低假阳性。
当比较所有14个池塘（排除排干数据）时，检测方法对检测到的物种数量有显著影响。低严格度eDNA检测到的物种数量显著高于围网捕捞，且与高严格度eDNA相比也倾向于检测更多物种。
不同调查方法检测到的独特物种
检测方法对检测到的“独特物种”（即仅被一种方法检测到的物种）数量有极显著影响。低严格度eDNA检测到的独特物种数量最多（平均2.3种），显著高于传统方法和高严格度eDNA。这表明eDNA（尤其是低严格度解读时）能发现更多未被传统方法捕获的物种，但其中部分可能是假阳性。
量化群落生物多样性指标
不同方法（eDNA、排干、电捕鱼、围网捕捞）对香农多样性指数的估计没有显著差异，表明eDNA和传统方法在评估群落生物多样性水平上具有可比性。
确定量化鱼类丰富度所需的最小eDNA样本数
通过Chao 2多样性估计和功率分析，研究发现需要约6个eDNA样本就足以在50%的类似池塘中量化所有物种丰富度。研究进一步估计，11个样本应足以在95%的类似池塘生态系统中量化总的鱼类丰富度。分析未发现池塘的生物多样性或面积大小对所需采样量有显著影响。
eDNA宏条形码读数与相对物种丰度之间的关系
对于M-Mito和PS1两个标记，相对eDNA读数丰度均与通过传统采样获得的单位努力渔获量相对丰度显著正相关。其中M-Mito标记的相关性更强（Effron伪2= 0.601）。这表明eDNA宏条形码数据能在一定程度上反映物种的相对丰度。
结论与讨论
本研究通过将eDNA采样与池塘排干获得的绝对种群普查数据相结合，独特而有力地验证了eDNA宏条形码技术的效能。结论明确指出，eDNA能够提供与传统物理捕获技术相当的鱼类生物多样性估计。其核心优势在于对低丰度物种的检测灵敏度更高，能够更完整地揭示真实的物种组成，尤其是在检测稀有、敏感或难以捕获的物种方面潜力巨大。然而，eDNA也存在明显的挑战，即更容易产生假阳性结果。这突显出在数据解读中设定并应用合适的严格度过滤标准至关重要。提高严格度能在仅小幅增加假阴性的情况下，大幅减少假阳性。此外，严格控制现场和实验室污染也是降低假阳性的关键。
在实践应用层面，研究发现对于所研究的小型静水生态系统，大约11个eDNA样本就足以可靠地量化鱼类物种丰富度，这为设计高效且具有成本效益的生物监测方案提供了具体指导。同时，研究证实eDNA宏条形码读数与物种相对丰度存在正相关，这为未来利用eDNA数据进行半定量甚至定量分析奠定了基础，尽管要达成这一目标仍需克服引物扩增偏好性等技术挑战，并更深入地理解eDNA在环境中的产生和动态变化过程。
总之，这项研究强化了eDNA宏条形码作为一种强大工具的地位，它既可单独使用，也可作为传统调查方法的补充，特别适用于需要快速、非侵入性且高灵敏度地评估水生生物多样性的场景，例如对濒危物种的监测、早期入侵物种预警以及大范围的生态普查。随着技术的进一步标准化和我们对eDNA生态学的深入理解，它将在水生生态系统的保护和管理中发挥越来越重要的作用。
