壳聚糖与γ-聚谷氨酸界面聚电解质复合物纤维在肌腱仿生与再生中的应用

《Carbohydrate Polymers》：Chitosan and γ-polyglutamic acid interfacial polyelectrolyte complexation fibers for tendon biomimicry and regeneration

生物仿生肌腱移植体开发及性能优化研究通过界面聚电解质复合纺丝技术结合编织加固工艺，成功制备出具有多层次纤维结构和优异机械性能的仿生肌腱 scaffold。研究采用壳聚糖与γ-聚谷氨酸复合体系，通过动态培养和生长因子递送机制，有效促进间充质干细胞分化和胶原沉积，经疲劳测试验证其耐久性和粘弹性符合临床应用要求。

　　

陈浩轩|陈世恒|陈世贤|刘宇忠|吴晨德|陈建勋|王祖伟

台湾新竹市国立清华大学材料科学与工程系

摘要

目前使用的肌腱移植物，包括自体和异体选项，受到可用性、供体部位并发症以及免疫排斥风险等限制。虽然人工肌腱提供了潜在的替代方案，但仍然存在诸如蠕变、应力松弛、疲劳和较差的组织整合等缺点。为了克服这些挑战并满足未满足的临床需求，本研究提出了一种通过界面聚电解质复合纺丝技术制备的仿生肌腱移植物，并结合了定制的扭转和编织增强方式。这种分层仿生设计考虑了肌腱修复和再生所需的解剖学和生理学特征。动态强化培养和生长因子的整合，加上空间控制的精细度，进一步提高了替代物的整合性和功能性，其特性包括与天然肌腱组织相似的肌腱相关蛋白分泌和宝贵性能。疲劳测试表明，这种编织支架在加载-卸载循环下的耐用性和粘弹性突显了其适用于日常活动的潜力。这种自下而上的组装方法复制了天然肌腱组织的生理、生物和机械特性。从未来发展的角度来看，这项研究在肌腱组织工程领域取得了重要进展，为肌腱替代提供了具有巨大前景的生物启发型编织生物纺织品。

引言

肌腱再生是一个公认的临床挑战，尤其是在阿基里斯肌腱中，该肌腱血管供应不足、细胞密度低且承受高机械负荷，导致内在愈合能力差、疤痕形成频繁以及生物力学强度受损（Zhang等人，2024年）。目前的肌腱修复和替代策略通常包括自体移植、异体移植和异种移植。然而，这些方法面临可用性有限、供体部位并发症、免疫排斥以及跨物种疾病传播风险等问题（Snedeker & Foolen，2017年）。尽管治疗策略已取得显著进展，但目前还没有任何疗法能够完全恢复受伤前的肌腱功能（Ruiz-Alonso等人，2021年）。这些限制凸显了迫切需要替代解决方案，包括能够更有效地模仿天然肌腱结构和功能的组织工程肌腱替代物。

如今，已经提出了多种方法（Silva等人，2020年）。其中，电纺丝和3D生物打印是两种广泛用于肌腱和韧带组织工程支架制造的技术。电纺丝可以生产出具有高孔隙率和与细胞外基质相似结构的纤维支架。尽管具有潜力，但电纺丝也存在一些局限性，如需要使用有机溶剂、操作电压高、细胞渗透有限以及电纺天然聚合物的机械强度不足（Khorshidi等人，2016年）。此外，电纺支架的粘弹性特性尚未得到充分研究（Carvalho & Kumar，2023年），这表明需要进一步开发以满足功能性肌腱替代物的要求。另一方面，3D生物打印可以根据医学影像选择合适的生物墨水来制造支架。然而，用于3D生物打印的天然聚合物的机械稳定性并不理想，而合成材料虽然机械强度较高，但往往缺乏生物相容性。值得注意的是，这两种方法都存在共同的缺陷，例如加工过程中可能对细胞造成损伤以及结构完整性有限（Potyondy等人，2021年；Ruiz-Alonso等人，2021年）。

界面聚电解质复合（IPC）纺丝技术为生物医学应用提供了多项优势。其在室温、中性pH值和水性环境下的温和制造条件，有助于高效、生物友好的封装各种生物活性成分，如小分子药物、生长因子、基因传递载体和细胞（Wan等人，2016年）。IPC纺丝在控制空间排列方面表现出显著的多功能性，能够形成多种纤维结构，包括核壳和多相配置，从而扩展了纤维制造技术的应用范围（Du等人，2014年；Wu等人，2023年）。值得注意的是，IPC纤维表现出优于其他微纤维或纳米纤维形成方法的增强异质机械性能（Foo等人，2025年）。电纺丝、3D生物打印和IPC技术的详细比较见补充表S1。在本研究中，设计了类似于天然肌腱超结构的各向异性结构，以匹配聚电解质模式。它提供了卓越的可编程性和细胞及生长因子的封装能力，超越了传统的纺丝技术。此外，还采用了扭转和编织技术来优化支架的机械性能，使其更接近天然肌腱组织的特性。

选择壳聚糖和γ-聚谷氨酸（γ-PGA）作为IPC纤维的聚离子，生成具有增强物理化学特性的复合纤维。壳聚糖是一种通过壳聚糖脱乙酰化获得的多糖，是仅次于纤维素的第二大天然生物聚合物。它的特性包括无毒、可生物降解、抗菌性能和促进伤口愈合的能力，使其适用于生物医学领域（Geng等人，2023年）。作为一种非人体来源的聚合物，其相对较慢的生物降解速率与肌腱组织再生的长期过程相匹配（Islam等人，2020年），为肌腱修复提供了显著优势。另一方面，γ-PGA是一种天然存在的多肽，在组织工程中因其优异的生物相容性、可生物降解性和与天然细胞外基质（ECM）蛋白质的结构相似性而受到广泛关注（Yang等人，2020年）。γ-PGA具有强烈的细胞粘附性，有助于细胞迁移和增殖。其亲水性还能防止细胞膜收缩，作为术后组织粘附的有效屏障，其抗炎作用进一步促进了组织修复和伤口愈合（Park等人，2021年）。本研究利用壳聚糖和γ-PGA之间的聚电解质复合体形成用于肌腱再生医学。丝素纤维被用作涂层材料，以增强支架性能，因为其疏水性可以减少过量吸水并在生理条件下保持结构完整性（Wang等人，2021年）。此外，其优异的机械性能和促进细胞粘附及增殖的能力提供了机械增强和生物功能（Koh等人，2015年）。

将生长因子整合到支架材料中是克服肌腱自我修复能力有限的一种有前景的治疗策略。其中，转化生长因子-β1（TGF-β1）和基本成纤维细胞生长因子（bFGF）已被确定为肌腱再生过程中的关键介质。TGF-β1在肌腱愈合中起关键作用，促进炎症阶段后的细胞招募，在增殖阶段促进细胞外基质和III型胶原的合成，在重塑阶段调节I型胶原的产生（Crispim等人，2017年）。它还被证明可以通过上调肌腱特异性基因表达来促进骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）的肌腱分化（Zhang等人，2018年）。bFGF在肌腱修复和再生中发挥了重要作用，通过促进细胞增殖、刺激胶原产生和加速肌腱内愈合（Docheva等人，2015年）。这些生长因子因能够改善肌腱组织均匀性和促进胶原纤维分化和受伤肌腱的成熟而受到广泛关注（Jiang等人，2024年）。然而，它们的半衰期较短，限制了这些生长因子的临床应用。为了解决这一问题，引入了聚电解质复合纳米颗粒作为递送载体，因为它们对TGF-β1和bFGF具有结合亲和力，从而实现可控释放和持续的生物活性（Rider & Mulloy，2017年；Place等人，2014年）。除了通过生长因子进行生化刺激外，机械刺激在肌腱组织工程中也变得至关重要。提供体外机械刺激的生物反应器可以复制生理条件，增强细胞分化和肌腱生成（Qin等人，2015年）。研究表明，机械刺激对细胞粘附、排列、增殖以及I型和III型胶原的表达有积极影响，支持了工程肌腱组织的发展（Rinoldi等人，2019a）。

本研究开发了一种仿生肌腱支架，复制了天然肌腱组织的结构、生物和机械特性（图1）。我们的策略是利用IPC技术进行支架制造，利用带相反电荷的聚合物溶液之间的相互作用在界面形成聚电解质复合体。这一过程在保持生物相容性和结构仿真的同时，能够在常温下进行。

部分摘要

类似肌腱的IPC支架的制备和表征

为了制备用于IPC纺丝的聚阳离子和聚阴离子溶液，将壳聚糖（3% w/v）溶解在2% v/v醋酸中。壳聚糖由英国Biosynth有限公司提供（产品编号YC171030），是一种商业上可获得的非动物来源的聚合物，来源于双孢蘑菇的细胞壁材料。供应商报告称，该聚合物的重量平均分子量为13,000 Da（13 kDa），脱乙酰度为98%。聚阴离子溶液的制备...

类似肌腱的IPC支架的特性

天然肌腱组织具有分层结构，赋予了肌腱卓越的机械性能。受这种天然结构的启发，我们开发了一种自下而上的制造技术来制备模仿肌腱组织超结构的IPC支架（图2a）。通过设计专门的IPC收集系统和加入扭转装置，我们赋予收集到的纤维明确的层次方向。SEM图像显示...

讨论

本研究成功复制了天然肌腱组织中的分层结构，从微观纤维到临床可应用的支架。IPC系统是根据IPC纺丝的独特特性量身定制的，包括形成多样的结构、精确的空间排列以及在水性环境中微尺度上的高效封装。这些特性使得...

结论

在这项研究中，我们成功开发了一种具有高效肌腱修复和再生所需基本特性的仿生肌腱替代物。利用先进的IPC收集系统和定制设计的IPC纺丝仪器，我们制造出了层次结构紧密模仿天然肌腱组织的纤维。通过扭转和编织技术，实现了从微观尺度到临床相关尺寸的支架可扩展性。

作者贡献声明

陈浩轩：撰写——原始草稿、验证、项目管理、方法论、正式分析、数据管理、概念化。陈世恒：验证、监督、资源管理、方法论、研究、数据管理。陈世贤：验证、监督、方法论、正式分析、数据管理。刘宇忠：撰写——原始草稿、验证、监督、方法论、研究、数据管理。吴晨德：可视化、验证

财务利益

作者声明没有财务利益。

资金来源

该研究由国家科学技术委员会（NSTC）资助（NSTC 112-2221-E-007-037-MY3）。

未引用的参考文献

Meka等人，2017

Robinson等人，2021

Schwab等人，2020

Wan, Liao, Yim和Leong，2004

Zulkifli, Nordin, Shaari和Kamarudin，2023

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

我们感谢中央研究院的动物成像设施在磁共振成像方面的协助。我们也感谢国立清华大学的纳米技术、材料科学和微系统核心设施中心在SEM、TEM、FTIR和共聚焦显微镜方面的支持。