《Carbohydrate Research》：Enhanced ocular delivery of timolol maleate through thiolated chitosan nanoparticles/gellan gum-based hydrogels
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本研究制备了硫代壳聚糖纳米颗粒（TCS-NPs）/果胶糖凝胶（GG）缓释系统，用于青光眼眼用给药。通过FT-IR和Ellman法证实硫代壳聚糖改性，纳米颗粒尺寸271.4 nm，包封率60.3%。流变学显示结合凝胶不影响粘弹特性，但药物释放较自由体系减慢。MTT测试表明无显著毒性，该系统通过in situ凝胶化延长药物滞留时间，提高青光眼治疗效果。
Mehdi Bayrami|Marziyeh Fathi|Elaheh Dalir Abdolahinia|Khosro Adibkia
伊朗大不里士医科大学生物医学研究所药物纳米技术研究中心
摘要
本研究制备了一种含有噻酚醇马来酸盐（TM）的硫醇化壳聚糖纳米颗粒（TCS-NPs）配方，该配方分散在吉兰胶（GG）中（TM@TCS-NPs/GG），用于TM的眼部递送。为此，向壳聚糖（CS）中添加了硫醇基团，通过FT-IR和Ellman方法确认了这一过程，其巯基含量为198.6 ± 18.7 μmol/g。通过脱溶法制备了载药纳米颗粒，并评估了其粒径、ζ电位和药物包封效率。优化后的TM负载TCS-NPs的粒径为271.4 nm，多分散指数（PDI）为0.3，包封效率为60.3%。研究了该配方的流变性能、形态和药物释放行为。流变学研究表明，向水凝胶中添加纳米颗粒对流变性能影响不大。与游离纳米颗粒制剂相比，纳米颗粒在水凝胶中的药物释放速度较慢。MTT试验显示，所制备的制剂没有显著的毒性。根据研究结果，TCS-NPs/GG系统在TM的持续眼部递送方面显示出良好的潜力。
引言
青光眼是一组以眼内压升高为特征的眼部疾病，可能导致视神经损伤甚至失明。青光眼分为开角型青光眼和闭角型青光眼两种类型。闭角型青光眼通常属于紧急情况，需要手术治疗，而开角型青光眼则主要通过药物控制眼内压来管理。尽管药物作用部位明确，但眼部药物递送仍面临挑战。由于眼泪不断产生以及药物被冲入鼻泪管，液体眼用制剂的有效性通常较低。大约90%的眼药水用于治疗眼睛前部疾病，但其通过角膜的生物利用度低于5% 1, 2, 3。因此，为了达到足够的治疗效果，必须缩短给药间隔并增加制剂中的药物浓度，这会导致患者依从性降低和副作用增加。基于纳米技术的药物递送装置的发展延长了药物在眼部的停留时间 4, 5, 6, 7。纳米颗粒（NPs）具有优异的组织渗透性和持久性，使患者能够减少给药间隔 8, 9, 10, 11, 12。壳聚糖（CS）作为一种阳离子多糖，在眼科治疗中得到了广泛研究，因为它具有生物相容性、低细胞毒性和增透效果 13, 14, 15。但在pH值高于6时，CS的正电荷密度降低，导致聚集和水溶性下降，从而影响其在眼表面（约7.4–7.8）的黏附性和增透性能 15, 16, 17, 18, 19。为了克服CS的这些限制，开发了硫醇化聚合物（thiomers）作为新型黏附材料。它们能够与黏蛋白中的半胱氨酸富集区域形成共价二硫键，从而比CS具有更强的黏附力 16。然而，硫醇化聚合物在生理条件下容易发生氧化降解，特别是在pH值高于5的水环境中 20，这严重限制了其眼部应用 20。眼表面的氧化应激环境尤为严峻，因为眼睛容易受到活性氧（ROS）的侵害 21。此外，如果硫醇化聚合物未受到保护，它们与黏液糖蛋白的相互作用会减弱，从而阻碍其通过黏液凝胶层 22。因此，保护硫醇功能（如使用抗氧化剂）对于维持其黏附性能至关重要。鉴于CS和TCS在生理条件下的这些局限性，在眼内原位凝胶化系统为增强药物保留提供了有吸引力的替代方案 23, 24。液体滴眼液便于简单、安全且重复给药。此外，其工业制备和制造也比固体和传统半固体形式更为容易。智能水凝胶的主要进步在于能够在眼表面受到各种生理刺激（如温度、pH值或离子强度）时触发溶胶-凝胶转变 25。原位激活的水凝胶在给药后立即凝胶化，不仅可以减少药物在角膜前的清除，还能延长其在眼表面的停留时间，并具有新的黏弹性特性 26。具有黏附特性的生物聚合物进一步延长了水凝胶在角膜表面的停留时间 26，从而提高了活性成分在眼表面的局部吸收，进而提高了其生物利用度和疗效 27, 28, 29, 30。吉兰胶（GG）在眼用环境中的凝胶化能力已被证实，基于GG的各种制剂在体内表现出更好的眼表面停留时间 31, 32, 33, 34, 35。
在本研究中，通过3-巯基丙酸（MPA）修饰制备了TCS，然后使用Ellman试剂评估了硫醇基团的取代程度。采用脱溶法制备了含有噻酚醇（TM）的TCS-NPs（TM@TCS-NPs），并研究了其特性（包括ζ电位、粒径、药物包封效率和药物释放行为）。随后将TM@TCS-NPs分散在GG溶液中，并通过扫描电子显微镜（SEM）、流变学研究、药物释放曲线和细胞毒性试验进行了评估。
材料
壳聚糖（CS）（中分子量（190,000-310,000 Da，基于粘度），脱乙酰化程度（75-85%），低酰基吉兰胶（Gelzan? CM），戊二醛（GA，25% v/v），1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDAC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），5,5'-二硫-双(2-硝基苯甲酸）（DTNB）和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）均购自美国Sigma-Aldrich公司。亚硫酸氢钠（NaMBS）和3-巯基丙酸（MPA）也用于实验。
壳聚糖的硫醇化
图1展示了TCS的合成和制备步骤、TCS-NPs的形成以及含有TM@TCS-NPs的GG水凝胶的示意图。通过添加硫醇基团，可以增强CS的生物黏附性能，因为这些基团可以与眼表面细胞的糖蛋白中的硫醇基团形成二硫键，从而提高制剂的黏附力。使用Ellman方法对硫醇基团的含量进行了定量测定。
结论
总之，TM被包封在TCS-NPs配方中并分散在GG水凝胶中，表现出缓慢的释放速率和良好的生物相容性。因此，该制剂适用于需要频繁使用眼药水的青光眼患者。本研究结果为开发新型原位凝胶剂治疗眼部疾病提供了支持；然而，还需要进一步的体外或离体黏附性研究。
CRediT作者贡献声明
Khosro Adibkia：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、资源管理、概念构思。Marziyeh Fathi：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、数据分析、概念构思。Elaheh Dalir Abdolahinia：方法学研究、数据分析。Mehdi Bayrami：初稿撰写、方法学研究、实验设计、数据分析
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
数据可用性
所有支持本研究结果的数据均包含在文章中。
资助
本研究是塔布里士医科大学PharmD学位论文（编号66831）的一部分，得到了该大学的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们衷心感谢塔布里士医科大学药物纳米技术研究中心和药学院的技术支持。
