一种清除牛磺酸结合胆汁酸异构体干扰的方法，以便在生物基质中使用同位素稀释液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析全氟辛烷磺酸盐（PFOS），并研究其他多反应离子监测（MRM）方法可能产生的干扰

《Chemosphere》：A clean-up method to remove taurine conjugated bile acid isomers interference for perfluorooctane sulfonate (PFOS) analysis in biotic matrices by isotope dilution LC-MS/MS and investigation of other MRMs interference

PFOS生物样本分析中采用溶剂交换结合固相萃取法有效去除taurodeoxycholate同系物干扰，并发现支链异构体P1MHpS对另一迁移离子造成干扰，提出计算校正公式，同时解决类固醇硫酸盐干扰问题。

　　

作者：Chunhai Yu、Gavin Stevenson、Robert Crough、Jesuina De Araujo、Alan Yates

澳大利亚超痕量实验室，国家计量研究所。地址：105 Delhi Road, 2113, North Ryde, NSW, 澳大利亚

摘要

本文介绍了一种用于去除生物样本中牛磺酸结合胆汁酸异构体对多反应监测（MRM）同位素干扰的方法，这些异构体的主要质荷比（m/z）为499 > 80，该方法适用于全氟辛烷磺酸（PFOS）的分析。在发现牛磺脱氧胆酸（TDCA）异构体产生干扰后，样品在氮气保护下蒸发至干态，然后用1%甲酸在乙腈中复溶，随后通过Agilent EMR-lip固相萃取（SPE）柱进行分离。洗脱液被浓缩后重新进行分析。该方法已成功应用于血清、肝脏、鸡蛋、虾和鱼类样本的PFOS分析，两种质荷比为499 > 80的过渡离子之间的测定结果具有可比性，加标回收率在70%至125%之间。此外，还研究了虾样本中另一种对m/z = 499 > 80的干扰来源，初步推测其为牛磺酸与不饱和脂肪酸的结合物。该方法还能有效去除人类血清样本中PFHxS（m/z = 399 > 80和m/z = 399 > 99）过渡离子的类固醇硫酸盐干扰。研究发现，全氟-1-甲基庚烷磺酸（P1MHpS，一种支链PFOS异构体）会干扰PFOS的定量分析，其对m/z = 499 > 99的响应因子为250%，对m/z = 499 > 80的响应因子为50%，从而导致PFOS含量被高估或低估。本文提出了P1MHpS和总PFOS含量的计算公式。约20%的血清样本中含有显著的P1MHpS，其含量占总PFOS的12%至27%，表明其在人体血清中具有较高的积累倾向。

引言

全氟和多氟烷基物质（PFASs）是一类自20世纪中叶以来在各种行业中生产和使用的高度氟化化学品。由于具有疏油、防水、抗温及降低摩擦等独特理化性质，PFASs被广泛应用于服装、家具涂层、炊具、食品包装等日常用品中（Erik, 2001）。此外，PFASs作为表面活性剂在水成膜泡沫中能有效灭火，已在军事基地和机场使用超过50年（Backe et al., 2013; D’Agostino and Mabury, 2014; Baren-Hanson et al., 2017）。

PFASs含有强碳-氟键，能够抵抗阳光、生物体内的酶以及环境中的细菌的降解。它们在环境中具有持久性，可长距离迁移，并在鱼类、鸟类、哺乳动物和人体中积累（Conder et al., 2008; Baygi et al., 2016; Langberg et al., 2019; Verreault et al., 2005; Greaves et al., 2012; Gyllenhammar et al., 2019）。最常见的PFAS化合物（如全氟辛烷磺酸（PFOS）在人体内的半衰期约为5年（Olsen et al., 2007）。PFASs与多种毒性效应相关，可能导致健康问题，如肝脏损伤（Bassler et al., 2019; Das et al., 2017）、甲状腺疾病（Lopez-Espinosa et al., 2012）、免疫功能下降（Liew et al., 2018; Stein et al., 2016）、癌症（McComb et al., 2020）、高胆固醇（Rebholz et al., 2016）、出生缺陷和生育问题（Stein et al., 2014; Liew et al., 2014; Bach et al., 2016）。

2002年，主要制造商自愿停止生产PFOS；2009年，《斯德哥尔摩公约》将PFOS及其盐类和相关物质列为附件B中的持久性有机污染物（UNEP, 2010）。根据2000至2012年间欧洲委员会成员国对食品中PFASs的监测报告，PFOS是最常见的PFAS化合物（检出率31%），且在鱼类内脏和可食用野味内脏中的浓度最高（EFSA, 2011; EFSA, 2012）。美国食品药品监督管理局（USFDA, 2021）也报告称，在2018-2019年间从受PFAS污染的农场采集的乳制品样本以及2010-2012年间从美国各地采集的零售鱼类和贝类样本中均检测到PFOS。中国（Zhou et al., 2014）、欧洲（Gyllenhammar et al., 2019; Yeung et al., 2013）和美国（Kato et al., 2014）的人体血清中也检测到PFOS为主导的PFAS化合物；同时，在本地动物中也频繁发现PFOS（Greaves et al., 2012; Braune and Letcher, 2013; Holmstrom and Berger, 2008; Dorneles et al., 2008）。

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是PFAS分析中最常用的分析技术（USEPA, 2009; USDoD&DoE, 2019; USFDA, 2019）。在生物样本中使用LC-MS/MS进行PFOS分析时，内源性化合物牛磺脱氧胆酸异构体（TDCAs）通常会与PFOS共同洗脱，干扰PFOS的主要质荷比m/z = 499 > 80的过渡。这些TDCAs的干扰会导致PFOS含量被高估（EFSA, 2011; Benskin et al., 2007; Keller et al., 2010; Reiner et al., 2012; Riddell et al., 2009）。为分离PFOS和TDCAs，研究人员使用了不同的固定相柱，如全氟-C8柱（FluoroSep RP Octyl柱（Benskin et al., 2007）和Epic FO-LB柱（Chung and Lam, 2014，美国新泽西州西柏林ES Industries公司）、Acquity UPLC HSS T3柱（Barbarossa et al., 2016）以及离子交换柱（RSpak JJ-50 2D，日本川崎Shodex Denko K.K.公司，Yeung et al., 2009）。然而，使用这些柱会增加分析时间，降低实验室的检测效率。TDCAs对m/z = 499 > 80过渡离子的干扰也促使许多实验室选择使用m/z = 499 > 99的次要过渡离子进行检测，尽管其灵敏度较低。一些研究还指出，除TDCAs外，其他未鉴定的化合物也可能干扰m/z = 499 > 99的过渡离子（Riddell et al., 2009; Apelberg et al., 2007）。

在我们的实验室中，使用三乙胺（TEA）作为流动相修饰剂，在反相C18柱上分离TDCAs和PFOS。不幸的是，TEA的存在显著缩短了分离柱的使用寿命（约三个月），并且会导致PFBA的色谱峰不对称。本项目的目标是去除样品制备过程中的TDCAs干扰，并研究其他可能的MRM同位素干扰对PFOS质荷比m/z = 499 > 80或m/z = 499 > 99的过渡离子的影响。

化学试剂和耗材

PFOS溶液混合物包含线性异构体和支链异构体（n-PFOS: br-PFOS = 78.8: 21.2；目录编号：PFAC-24PAR），以及用¹³C标记的内标全氟-1-[¹³C₈]辛烷磺酸（M8PFOS）和全氟-1-[1,2,3,4-¹³C₄]辛烷磺酸（MPFOS），以及单独的PFOS异构体P1MHpS，均由加拿大圭尔夫的Wellington Laboratories提供。在本方法中，PFOS混合物用作内标，M8PFOS用作提取内标，MPFOS用作回收内标。

TDCA异构体对PFOS定量（m/z = 499 > 80）的干扰

图S1（A）显示了三种TDCA异构体（TuDCA、TcDCA和TDCA）的色谱图，这些异构体的检测质荷比为m/z = 499 > 80。TuDCA在7.4分钟时洗脱，不会干扰br-PFOS（保留时间RT = 8.1和8.3分钟）或n-PFOS异构体（RT = 8.45分钟）；TcDCA的峰在br-PFOS和n-PFOS峰之间洗脱（RT = 8.41分钟），而TDCA（RT = 8.54分钟）部分与n-PFOS共洗脱。显然，TcDCA和TDCA的存在可能导致PFOS含量被高估（见图S2）。

结论

总结来说，本文提出的溶剂交换和SPE净化方法可以通过同位素稀释技术彻底去除生物样本（包括血清、肝脏、鸡蛋、鱼类和虾）中TDCAs对PFOS分析的干扰。此外，该方法还能去除血清样本中类固醇硫酸盐对PFHxS分析的干扰。其他可能干扰PFOS分析的化合物也在进一步研究中。

作者贡献声明

Chunhai Yu：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。 Gavin Stevenson：撰写、审稿与编辑、验证、项目监督、资源协调、方法学指导。 Robert Crough：方法学设计。 Jesuina De Araujo：数据分析。 Alan Yates：撰写、审稿与编辑。

注释

作者声明没有利益冲突。

资金来源

无。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

感谢Luke Baker提供部分SPE柱并对手稿提出意见。作者Chunhai Yu特别感谢Daniel Slee和Justyna Garbowska在论文准备和提交过程中的支持。