《Developmental Biology》：Identification of evolutionary conserved and diverged regulatory elements of embryonic
Msx1 expression among amniote species via 3D-genome analyses and in vivo assays.
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颅面发育中Msx1基因的物种特异性调控机制研究。通过4C-seq技术揭示鸡和鼠Msx1启动子周边三维基因组架构，鉴定出保守及物种特异性增强子，发现鸡与有袋类动物Msx1增强子保守而鼠类丢失，揭示顺式调控元件的动态进化驱动了咀嚼模式多样性。
和松良夫|井上由纪子|真鍋修|鈴木邦弘|井上隆吉
日本宫城县仙台市东北大学医学研究生院联合高级研究与转化医学中心（ART）发育神经科学系，邮编980-8575
摘要
Msx1基因编码一种同源框转录因子，该因子在器官发育过程中（如肢芽和颌原基）调节多种模式形成事件。在颅面发育中，Msx1不仅参与颌部的近端-远端模式形成，还参与不同牙齿类型沿近端-远端轴的空间排列。我们之前的研究表明，Msx1在颌原基中的表达存在物种特异性差异，这些差异有助于形成独特的牙齿排列模式。尽管已经鉴定出几个负责胚胎Msx1表达的近端增强子，但是否还存在其他增强子，以及这些调控元件的组合是否对发育中的颌原基中的Msx1表达模式有贡献，目前仍不清楚。
在这项研究中，我们利用4C-seq（一种三维基因组构象技术）来识别与Msx1启动子紧密相邻的基因组区域。通过这项分析，我们确定了包含Msx1位点的拓扑关联域（TAD）。结合基因组序列比较和体内报告基因实验，我们在该TAD中鉴定出了新的增强子，其中包括在发育中的颌原基中活跃的元件。值得注意的是，其中一些增强子仅在鸡和负鼠的基因组中存在，而在胎盘哺乳动物中不存在；而其他源自小鼠和负鼠的增强子在鸡和小鼠胚胎中表现出不同的时空模式。这表明Msx1位点的动态顺式调控进化可能负责物种特异性的颌部模式形成和牙齿排列。因此，这项研究为理解调控发育的增强子的进化动态提供了有价值的框架。
引言
Msx1基因编码一种同源框转录因子，它在发育中的组织和器官（包括外胚层、肢芽和颌原基）中调节多种模式形成事件，其脊椎动物同源物为Msx2（参见Davidson, 1995; Ramos and Robert, 2005的综述）。例如，在早期外胚层发育过程中，Msx1在非神经外胚层和神经板之间的神经边界处表达，在神经嵴的特异性形成中起关键作用（Tríbulo et al., 2003; Sakai et al., 2006; Ramos and Robert, 2005；另见补充图1）。此外，在颅面发育过程中，Msx1在下颌弓的神经嵴来源的外间充质、额鼻隆起和上颌突中表达（Tucker et al., 1998; Wakamatsu et al., 2019；参见McCollum and Sharpe, 2001的综述），从而参与颌部的近端-远端模式形成，并进一步影响不同牙齿类型的定位。磨牙、前磨牙、犬齿和门牙沿着近端-远端轴在特定物种特有的位置和数量上发育，这些共同构成了牙齿排列模式（称为牙齿公式）。牙齿公式的变化是哺乳动物物种间生态形态特化和生态位划分的基础。先前的研究表明，每种牙齿类型的定位是由颌原基中外间充质中特定区域表达的同源框转录因子（包括Alx3、BarX1和Msx1）调控的（McCollum and Sharpe, 2001的综述）。Msx1的表达由颌原基远端上皮分泌的BMP4激活，而BarX1则由近端上皮分泌的FGF8诱导（Tucker et al., 1998）。我们之前的研究表明，不同哺乳动物物种中Msx1在颌原基中的调控方式存在差异，这有助于形成物种特异性的牙齿排列模式（Wakamatsu et al., 2019）。值得注意的是，在发育中的下颌弓中，Msx1的表达域较广，并且与负鼠和雪貂的近端BarX1表达域有显著重叠；而在小鼠中，Msx1的表达仅限于原基的远端，这与啮齿类特有的牙齿排列模式相关（Wakamatsu et al., 2019）。
为了全面阐明Msx1在颌原基中的表达调控机制，有必要识别控制其转录的顺式调控元件以及与其结合的转录因子。先前在转基因胚胎中研究小鼠Msx1启动子上游区域的研究已经鉴定出几个驱动Msx1在胚胎组织中表达的增强子，包括背侧神经管、肢芽和心脏神经嵴来源的组织（MacKenzie et al., 1997; Miller et al., 2007, 2008）。然而，目前尚不清楚是否存在其他增强子，以及多个调控元件的组合活动是否对发育中的颌原基中Msx1的表达模式有贡献。
比较序列保守性长期以来被用作识别顺式调控元件的策略，其中包括潜在的增强子。然而，人们也认识到顺式调控元件可能在进化过程中获得或丢失，从而可能导致谱系特异性的基因表达谱（Levine, 2010; Rebeiz and Tsiantis, 2017的综述）。此外，即使在保守的元件内部，序列修饰也可能导致表达模式的分化（例如，Cretekos et al., 2008; Koshikawa et al., 2015; Booker et al., 2016; Pham et al., 2017; Wakamatsu and Suzuki, 2019；另见Carroll, 2005; Levine, 2010; Rebeiz and Tsiantis, 2017的综述）。因此，仅靠序列保守性不足以完全解释基因调控的时空特异性，尤其是在感兴趣的物种内部或物种间驱动进化结果时。相反，直接识别开放染色质和活性增强子的方法（如ATAC-seq和表观遗传组蛋白修饰分析）被广泛用于这一目的，特别是在小鼠等模型生物中，因为这些生物有大量的公共数据集。然而，这些方法的一个主要局限性是缺乏关于所鉴定增强子调控哪些基因的信息。
下一代测序技术的最新进展使得研究基因表达的表观遗传调控和高阶染色质结构成为可能（例如，Cotney et al., 2012；参见Li, 2021的综述）。特别是基于染色体构象捕获（3C）的方法，如4C或Hi-C，可以识别启动子与其潜在调控元件之间的物理相互作用（de Wit and de Laat, 2017的综述）。现在认识到染色质拓扑结构是发育基因表达时空调控的关键因素（Furlong and Levine, 2018的综述）。此外，由基因组重排引起的染色质结构改变可能导致新的基因表达模式，无论是在进化（例如，Marlétaz et al., 2023）还是病理（例如，Franke et al., 2016）背景下。
为了更好地理解Msx1在颌部模式形成过程中的表达调控，我们利用环状染色体构象捕获后进行测序（4C-seq；Krijger et al., 2020）来识别与Msx1启动子空间相邻的基因组区域。虽然我们希望识别出在负鼠和小鼠中促进Msx1物种特异性空间表达的增强子，但目前尚无高效的方法可以在负鼠或其他有袋类胚胎中进行大规模增强子筛选。由于我们之前使用鸟类胚胎来检测增强子活性（例如，Wakamatsu and Suzuki, 2019），并且FGF和BMP信号通路在调节Msx1和BarX1等颌部模式形成基因中的作用已在鸡中得到充分研究（Barlow et al., 1999; Chen et al., 2000; Wakamatsu et al., 2019），因此我们选择鸡胚胎进行初步的4C-seq分析和随后的增强子筛选。通过4C-seq和比较基因组学结合鉴定的候选调控序列随后在鸡胚胎中进行了测试，以评估增强子活性。我们进一步比较了鸡和小鼠颌原基的基因组和4C-seq数据集，从而鉴定出与Msx1位点相关的先前未表征的调控元件。这些数据为不同脊椎动物分支中颌部模式形成的进化调控提供了新的见解。
实验动物
所有动物实验均遵循东北大学的指导方针（《东北大学动物实验及相关活动规定》），并获得了东北大学医学院动物实验委员会（2015MdA-129-1, 2017MdA-209, 2018MdA-063）以及日本国立神经科学研究所动物护理和使用委员会的批准（批准编号2023004）。实验使用的动物为灰短尾负鼠（Monodelphis domestica）的繁殖群体
识别与Msx1启动子相邻的基因组区域
为了研究鸡胚胎颌原基中Msx1位点周围的三维染色质结构，我们首先进行了4C-seq分析（Krijger et al., 2020）。4C-seq是一种基于染色体构象捕获的技术，通过下一代测序来全面识别相互作用或空间相邻的DNA片段（Krijger et al., 2020）。从下颌收集间充质细胞
讨论
在这项研究中，我们进行了4C-seq分析，以识别在鸡和小鼠中与颌原基中Msx1启动子区域空间相邻的基因组序列。通过将4C-seq相互作用谱与物种间的序列保守性进行整合，我们生成了一组候选增强子元件，并评估了它们的体内调控活性。
CRediT作者贡献声明
真鍋修：撰写——审稿与编辑、方法学、数据管理。井上由纪子：撰写——审稿与编辑、方法学、研究。和松良夫：撰写——初稿、资源获取、项目管理、方法学、研究、资金申请、概念构思。井上隆吉：撰写——审稿与编辑、方法学、研究。铃木邦弘：撰写——审稿与编辑、资源管理
未引用参考文献
Acemel et al.,; Devidson, 1995; Foerst-Potts and Sadler, 1997; International Chicken Genome Sequencing Consortium, 2004; Lettice et al., 2017; Ramos and Bobert, 2005; Wakamatsu,.
数据可用性
数据可应要求提供。
资助
我们感谢以下机构的资助：来自JSPS的Yoshio Wakamatsu（KAKENNHI资助编号24570228）。
利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Yoshio Wakamatsu报告称 获得了日本学术振兴会的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。致谢
我们感谢Saito Daisuke博士和Uchikawa Masanori博士提供的质粒，以及Peter Krijger博士在4C-seq分析方面的建议。我们还要感谢Axel Newton博士对手稿的仔细阅读和评论。
