《Ecotoxicology and Environmental Safety》：PBX1 attenuates MeHg-induced apoptosis by reducing ROS accumulation, mitigating double-strand DNA breaks, and enhancing homologous recombination DNA repair in SH-SY5Y cells
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甲基汞（MeHg）是一种高神经毒性的有机重金属，其诱导的氧化损伤和DNA双链断裂（DSBs）严重威胁神经系统健康。现有抗氧化剂虽能减轻氧化应激，却无法有效修复DNA损伤。本研究聚焦先驱转录因子PBX1，探究其在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中抵抗MeHg毒性的作用机制。结果显示，MeHg以时间和剂量依赖方式下调PBX1表达，伴随ROS累积、细胞凋亡及易错非同源末端连接（NHEJ）修复增强；而过表达PBX1可逆转上述效应，减少DNA损伤，并通过激活BRCA1启动子活性增强同源重组（HR）修复。研究揭示了PBX1通过抑制ROS、减轻DSBs并促进高保真HR修复，从而拮抗MeHg诱导的细胞凋亡，为防治MeHg神经毒性提供了新靶点与策略。
在环境健康领域，汞污染一直是全球关注的重大公共卫生问题。其中，有机汞化合物甲基汞（MeHg）因其强大的神经毒性而备受瞩目。它能够跨越血脑屏障，在脑组织中蓄积，尤其对发育中的婴幼儿神经系统造成不可逆的损害。甲基汞的毒性核心机制之一是在体内代谢过程中产生活性氧（ROS），引发氧化应激，进而导致包括DNA双链断裂（DSBs）在内的严重损伤。DNA是生命活动的蓝图，双链断裂堪称最致命的DNA损伤形式，若不能得到及时、正确的修复，将引发基因组不稳定，最终导向细胞凋亡或癌变。有趣的是，我们的细胞拥有两套主要的DSBs修复工具：高保真的同源重组（HR）和快速但易错的非同源末端连接（NHEJ）。然而，现有研究发现，常用抗氧化剂如抗坏血酸虽能清除ROS，却对MeHg引起的DSBs修复无能为力，甚至可能干扰修复过程，留下基因毒性隐患。这就提出了一个关键科学问题：是否存在一种内源性的保护因子，能够“双管齐下”，既抵御氧化攻击，又能主动增强细胞的高保真修复能力，从而为神经元提供更全面的保护？本研究将目光投向了一个名为PBX1的先驱转录因子。PBX1已知在神经发生和神经元存活中扮演关键角色，并在其他疾病模型中显示出缓解氧化应激和促进DNA修复的潜力。那么，在甲基汞这场针对神经元的“氧化与基因双重风暴”中，PBX1能否挺身而出，扮演守护者的角色？这项发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》的研究，为我们揭晓了答案。
为探究上述问题，研究人员主要运用了以下关键技术方法：利用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系构建体外模型；通过蛋白质印迹法（Western blot）检测关键蛋白表达水平；使用流式细胞术结合DCFH-DA染色检测细胞内ROS水平，并结合Annexin V-APC/7-AAD染色检测细胞凋亡；采用彗星实验（中性彗星实验）评估DNA损伤程度；通过双荧光素酶报告基因实验验证PBX1对BRCA1基因启动子的转录调控活性；并运用生物信息学工具JASPAR数据库预测PBX1在BRCA1启动子上的潜在结合位点。
3.1. MeHg显著降低SH-SY5Y细胞中PBX1的表达
研究人员首先发现，用不同浓度（0.5、1.0、2.0 μM）的MeHg处理SH-SY5Y细胞24小时，或以1.0 μM MeHg处理不同时间（1、3、6、12、24小时），均能显著降低PBX1的蛋白表达水平，且呈现时间和剂量依赖性。这提示MeHg暴露会抑制细胞内源性保护因子PBX1的表达。
3.2. PBX1过表达显著减轻MeHg诱导的细胞死亡
通过慢病毒转导成功构建了稳定过表达PBX1的SH-SY5Y细胞株。MTT实验显示，与仅用空载体转导并暴露于MeHg的细胞相比，过表达PBX1并暴露于MeHg的细胞存活率显著提高。这表明PBX1过表达能有效抵抗MeHg引起的细胞毒性。
3.3. PBX1过表达减轻MeHg诱导的ROS积累
流式细胞术检测显示，MeHg处理能迅速（3小时）并持续地（24小时）升高细胞内ROS水平。而过表达PBX1能显著抑制MeHg诱导的ROS过度积累，说明PBX1具有抗氧化应激的作用。
3.4. PBX1过表达挽救MeHg诱导的细胞凋亡
流式细胞术和蛋白质印迹实验共同证实，MeHg暴露显著提高了细胞凋亡率，并上调了凋亡相关蛋白细胞色素C（Cyt C）、Cleaved-Caspase-3、89 kDa PARP1片段以及57 kDa AIF（凋亡诱导因子）的表达，同时下调了全长PARP1（116 kDa）和PAR（聚ADP核糖）的水平。这表明MeHg同时诱发了Caspase依赖性和Caspase非依赖性（Parthanatos）两条凋亡通路。而过表达PBX1能有效逆转这些蛋白的表达变化，显著降低细胞凋亡率。
3.5. PBX1过表达减少MeHg诱导的DNA损伤
彗星实验通过测量橄榄尾矩（OTM）值来量化DNA损伤。结果显示，MeHg处理显著增加了OTM值，且损伤程度随暴露时间延长而加剧。而过表达PBX1能显著降低MeHg引起的OTM值升高，表明PBX1能有效减轻MeHg诱导的DNA损伤。
3.6. PBX1过表达增强MeHg诱导的DSBs的HR修复
蛋白质印迹分析揭示了PBX1对DNA损伤修复通路的精细调控。在正常条件下，过表达PBX1本身即可上调HR修复关键蛋白BRCA1和RAD51的表达，并下调NHEJ通路相关蛋白53BP1。MeHg暴露后，细胞表现为HR修复能力下降（BRCA1、RAD51下调），同时易错的NHEJ修复增强（53BP1、KU70上调）。而过表达PBX1能逆转这一趋势：它进一步上调MeHg暴露下的BRCA1和RAD51表达，同时抑制53BP1和KU70的上调，表明PBX1能促进高保真的HR修复，同时抑制易错的NHEJ修复。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，PBX1能够显著增强BRCA1基因的启动子活性，从转录水平解释了其调控HR修复的分子机制。
归纳研究结论与讨论，本研究的核心发现在于系统阐明了先驱转录因子PBX1在抵抗甲基汞神经毒性中的多重保护作用。其重要意义体现在以下几个方面：首先，在机制层面，研究揭示了PBX1并非仅仅作为一个简单的抗氧化因子，而是扮演了“基因组守护者”的角色。它通过抑制ROS积累从源头减少DNA损伤的发生，同时通过转录激活BRCA1等关键基因，主动增强细胞的高保真同源重组修复能力，并抑制易错的非同源末端连接修复，从而在氧化损伤和基因组稳定性两个层面构建了立体防御网络。其次，在毒性干预策略上，本研究指出了传统单一抗氧化剂（如抗坏血酸）的局限性——仅清除ROS而不修复DNA损伤，可能遗留基因毒性风险。而PBX1展现出的“抗氧化”与“促修复”双重功能，为开发针对神经毒物诱导的氧化-基因毒性复合损伤的新型防治策略提供了全新的靶点和思路。最后，尽管研究采用了SH-SY5Y细胞系这一经典神经毒性模型，并承认其在转化应用上存在一定局限，但其扎实的机制研究为后续在更接近生理状态的模型（如iPSC来源的神经元）中进行验证奠定了坚实基础。总之，这项研究不仅深化了对甲基汞神经毒理机制的理解，更发现了一个极具潜力的内源性保护因子PBX1，为预防和治疗重金属相关的神经系统疾病带来了新的希望。
