《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Gestational fluoride exposure compromises ovarian function via SIRT1-ATF4 axis in female offspring
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【编辑推荐】为应对环境污染导致的不孕症挑战，本研究聚焦孕期氟暴露对后代卵巢功能的影响。研究人员通过动物和细胞模型，揭示了氟化物通过下调SIRT1，增加组蛋白H3K9ac乙酰化，从而上调ATF4/CHOP促凋亡通路，导致卵巢细胞凋亡和功能紊乱的机制。关键发现是SIRT1特异性激动剂白藜芦醇(Res)能有效逆转上述损伤。这项研究为理解环境因素导致的跨代生殖毒性提供了新机制，并为相关卵巢功能障碍的防治提供了潜在靶点。
在全球生育率下降和环境污染加剧的双重背景下，女性生殖健康，特别是卵巢功能的保护，已成为一个紧迫的公共卫生议题。卵巢储备在胎儿期就已建立，如同女性一生的“生育资本”，其数量和质量极易受到宫内不良环境的影响。氟化物是一种广泛存在于水、土壤和工业产品中的环境污染物，尽管它在防龋齿方面有益，但过量摄入已被证实对多个系统产生毒性，其内分泌干扰特性尤其令人担忧。既往研究多关注氟化物对成年个体生殖系统的直接影响，但对于母亲在怀孕期间接触氟化物，是否会“祸及子孙”，影响女儿未来的卵巢健康和生育能力，其背后的生物学机制却如同一团迷雾。解开这个谜团，不仅关乎对“成年疾病胎儿起源”学说的深入理解，更是为预防和治疗因环境暴露导致的卵巢功能障碍提供科学依据的关键一步。
为了回答这一系列问题，以顾燕楠、施亚军、魏斌等研究人员组成的研究团队在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了他们的最新成果。他们巧妙地构建了孕期氟暴露的小鼠模型，并联合使用人卵巢颗粒细胞系(KGN cells)进行体外验证，旨在阐明孕期氟暴露损害雌性后代卵巢功能的具体分子通路，并探索潜在的治疗干预策略。
研究人员在方法学上主要运用了以下几项关键技术：首先，他们建立了C57BL/6J小鼠孕期氟暴露模型（母鼠从妊娠第1天至第20天饮用含100 mg/L氟化钠的水），并通过对子代小鼠进行动情周期监测、血清激素（FSH、E2、AMH）ELISA检测以及卵巢组织HE染色和TUNEL染色，从表型上评估卵巢功能。其次，他们利用KGN细胞构建了氟化钠处理的体外模型，通过CCK-8、流式细胞术检测细胞活力和凋亡。在分子机制探索层面，团队广泛应用了RT-qPCR和Western Blotting技术检测SIRT1、ATF4、CHOP及凋亡相关蛋白（BAX、BCL-2、Cleaved Caspase-3）的表达变化。尤为关键的是，他们通过染色质免疫共沉淀技术分析了组蛋白H3K9ac在ATF4基因启动子区的富集情况，以揭示表观遗传调控机制。最后，他们使用SIRT1的特异性激动剂白藜芦醇(Resveratrol)在动物模型和细胞模型中进行“拯救”实验，验证了SIRT1-ATF4轴的核心地位。
3.1. 孕期氟暴露对雌性后代卵巢功能产生不利影响
研究人员发现，与对照组相比，孕期暴露于氟化钠的雌性后代小鼠卵巢体积和卵巢指数（卵巢重量/体重）显著减小。它们的动情周期从正常的约5天延长至约8天，主要延长了动情前期和动情间期。血清学检测显示，促卵泡激素(FSH)水平升高，而雌二醇(E2)和抗缪勒管激素(AMH)水平下降。卵巢组织切片分析进一步证实，氟暴露组小鼠的原始卵泡数量减少，闭锁卵泡比例显著增加。这些结果表明，孕期氟暴露确实会导致后代出现卵巢储备下降和功能紊乱。
3.2. 孕期氟暴露通过ATF4-CHOP信号通路诱导雌性后代卵巢细胞凋亡
为了探究卵巢功能损伤的机制，研究人员关注到细胞凋亡。TUNEL染色显示，氟暴露组小鼠卵巢中凋亡细胞数量显著增多。分子水平分析发现，氟暴露组卵巢中Atf4和Chop的mRNA表达上调，同时促凋亡蛋白BAX表达增加，抗凋亡蛋白BCL-2表达减少，BAX/BCL-2比值升高，凋亡执行蛋白Cleaved Caspase-3水平也上升。这说明ATF4-CHOP通路介导的细胞凋亡是氟暴露导致卵巢损伤的核心机制之一。
3.3. ATF4-CHOP通路介导氟化钠处理的KGN细胞凋亡
在体外实验中，用3 mM氟化钠处理KGN细胞同样能诱导细胞凋亡，并上调ATF4和CHOP的表达，激活相同的凋亡通路。更重要的是，当使用小干扰RNA(siRNA)敲低ATF4后，CHOP表达下降，凋亡通路被抑制。这直接证明了ATF4在氟诱导的颗粒细胞凋亡中起着关键的上游调控作用。
3.4. SIRT1介导的H3K9ac去乙酰化调控Atf4转录，并导致氟诱导的雌性后代卵巢功能障碍
接下来，研究深入到了表观遗传层面。沉默信息调节因子1(SIRT1)是一种依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶。研究人员发现，氟暴露组后代卵巢及KGN细胞中SIRT1蛋白水平显著降低，而组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化(H3K9ac)水平升高。通过生物信息学预测和染色质免疫共沉淀实验，他们证实氟暴露增加了H3K9ac在Atf4基因启动子区的结合，从而促进了Atf4的转录。在KGN细胞中敲低SIRT1会导致ATF4表达上调，而敲低ATF4不影响SIRT1表达，证明了SIRT1位于ATF4的上游进行调控。
3.5. SIRT1介导的H3K9ac去乙酰化调控ATF4转录并调节KGN细胞凋亡
这部分进一步在细胞层面验证了SIRT1-H3K9ac-ATF4调控轴。氟化钠处理KGN细胞同样导致SIRT1下降和H3K9ac升高，且ChIP实验证实ATF4启动子区的H3K9ac富集增加。这完整勾勒出氟化物通过下调SIRT1，减少其对H3K9ac的去乙酰化作用，导致ATF4启动子区乙酰化水平升高，进而促进ATF4转录和表达的分子路线图。
3.6. 白藜芦醇通过上调SIRT1拯救氟诱导的后代卵巢功能障碍
白藜芦醇是已知的SIRT1特异性激动剂。在动物拯救实验中，给予氟暴露后代小鼠白藜芦醇处理后，其卵巢体积和指数得到改善，动情周期缩短，原始卵泡数量增加，闭锁卵泡减少，卵巢细胞凋亡也被显著抑制。分子机制上，白藜芦醇处理上调了SIRT1表达，降低了H3K9ac水平，进而下调了ATF4、CHOP的表达，并逆转了凋亡相关蛋白的变化。
3.7. 补充白藜芦醇拯救氟诱导的KGN细胞凋亡
在细胞实验中，白藜芦醇与氟化钠共处理，能够有效抑制氟化钠引起的KGN细胞凋亡。同样，它通过激活SIRT1，降低H3K9ac乙酰化，抑制了ATF4/CHOP通路的激活。
综合以上结果，本研究得出明确结论：孕期氟暴露作为一种不良宫内刺激，会下调后代卵巢中SIRT1的表达与活性。SIRT1的减少导致其对组蛋白H3K9ac的去乙酰化作用减弱，使得ATF4基因启动子区的H3K9ac乙酰化水平异常升高。这种表观遗传修饰“打开”了ATF4的转录开关，导致ATF4蛋白表达上调。高表达的ATF4进而激活其下游靶基因CHOP，改变BAX/BCL-2的平衡，最终启动线粒体凋亡通路，导致卵巢颗粒细胞大量凋亡、卵泡闭锁增加，从而引起卵巢储备下降和功能紊乱。这一完整的信号轴被定义为SIRT1-ATF4-CHOP凋亡信号轴。
在讨论部分，作者强调了这项研究的转化医学意义。它不仅首次系统揭示了孕期氟暴露损害雌性后代卵巢功能的表观遗传学机制，更重要的是，将SIRT1确立为一个有潜力的治疗靶点。研究证实，使用其天然激动剂白藜芦醇进行干预，可以有效逆转上述病理过程，改善卵巢表型。这为临床上防治因环境毒素暴露导致的卵巢功能不全或早发性卵巢功能不全提供了全新的思路和潜在的药物候选方案。尽管研究存在一些局限性，如未直接测定子代卵巢组织氟浓度、未在体内使用基因敲除技术直接验证ATF4的必要性等，但其构建的清晰机制框架和成功的药理学干预，无疑为深入理解环境与生殖健康的跨代关联写下了重要一笔。
