《Ecotoxicology and Environmental Safety》：N-(1,3-dimethylbutyl)-N′-phenyl-p-phenylenediamine-quinone (6PPD-Q) induces osteoporosis by a mechanism involving CX43-mediated mitochondrial autophagy dysfunction in bone marrow mesenchymal stem cells
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本研究聚焦新兴环境污染物6PPD-Q的骨毒性，通过整合网络毒理学、单细胞测序与分子对接技术，首次揭示其通过下调CX43蛋白抑制BMSCs线粒体自噬，导致骨质疏松的分子机制，为环境污染物骨损伤防治提供了新靶点。
随着橡胶工业的蓬勃发展，轮胎添加剂6PPD（N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基对苯二胺）经臭氧氧化后产生的毒性代谢物6PPD-Q（N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基对苯二胺醌）已成为全球性的新兴环境污染物。其在淡水、空气和土壤中广泛检出，不仅导致鲑鱼急性死亡，更在人类尿液中检测到纳克级残留，尤其对儿童和孕妇暴露风险更高。近年研究发现6PPD-Q具有多器官毒性，但对其骨骼系统影响的研究仍属空白。骨质疏松（OP）作为全球重大公共卫生问题，与年龄相关的骨折风险显著增加，而环境污染物对骨代谢的潜在影响亟待阐明。
为系统揭示6PPD-Q的骨毒性机制，研究团队在《Ecotoxicology and Environmental Safety》发表论文，通过多组学整合策略开展创新性研究。技术方法包括：从骨质疏松患者和GeneCards数据库获取OP相关靶点，利用CTD数据库筛选6PPD-Q作用靶点；构建蛋白互作网络（PPI）筛选核心靶点；基于单细胞RNA测序（GSE147287）定位关键细胞类型；采用分子对接和100纳秒分子动力学模拟验证靶点结合稳定性；建立大鼠12周6PPD-Q暴露模型（1 mg/kg和10 mg/kg剂量）及BMSCs体外干预模型，通过Micro-CT、转录组测序、免疫组化/荧光、Western blot等技术评估骨微结构、细胞分化及线粒体自噬功能。
3.1 6PPD-Q与骨质疏松的毒性关联分析
通过转录组测序和数据库整合获得7775个OP相关差异基因，与CTD数据库1361个6PPD-Q靶点取交集，筛选出460个共享靶点。KEGG富集分析显示线粒体自噬（mitophagy）为显著富集通路，PPI网络筛选出41个核心靶点。
3.2 单细胞RNA测序确定关键细胞与靶点
分析GSE147287数据集发现，BMSCs中41个核心靶点表达最显著。进一步筛选出PDGFRB、MMP2、FYN和CX43（GJA1）为6PPD-Q诱导OP的关键靶点。
3.3 分子对接验证靶点结合
6PPD-Q与CX43结合能达-5.24 kcal/mol，分子动力学模拟（100 ns）证实复合物结构稳定（RMSD≈2.2 ?），氢键数维持2个左右，表明特异性结合。
3.4 动物实验证实6PPD-Q诱导骨质疏松
大鼠经12周6PPD-Q暴露后，Micro-CT显示骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）显著降低，骨小梁数量减少、间距增宽；HE染色证实骨微结构破坏，呈剂量依赖性。
3.5 转录组测序揭示分子机制
大鼠胫骨RNA-seq显示6PPD-Q高剂量组CX43表达显著下调，KEGG富集再次验证线粒体自噬通路激活。
3.6 免疫组化与蛋白表达验证
IHC显示CX43蛋白表达随6PPD-Q剂量增加而降低；IF检测发现LC3B（自噬标志物）荧光减弱，TOM20（线粒体外膜蛋白）荧光增强，提示线粒体自噬受阻。Western blot证实RUNX2、BMP2、Beclin-1、LC3B-II/I下调，TOM20、HSP60积累。
3.7 体外实验验证细胞机制
BMSCs经5 ng/mL和50 ng/mL 6PPD-Q干预后，CCK-8显示细胞活力抑制，ALP和ARS染色示成骨分化能力减弱，流式细胞术检测凋亡率增加。CX43抑制剂Gap19联合处理加剧上述效应，IF显示LC3B斑点减少、TOM20积累，证实CX43介导的线粒体自噬功能障碍为核心机制。
该研究首次系统阐明了6PPD-Q通过下调CX43抑制BMSCs线粒体自噬，进而导致骨质疏松的分子通路。其创新性体现在：整合多组学技术精准定位CX43为关键靶点，通过体内外实验验证了环境污染物干扰骨代谢的新机制。研究结果不仅揭示了6PPD-Q的骨毒性风险，更为开发针对CX43/线粒体自噬通路的骨骼保护策略提供了理论依据。未来需开展慢性低剂量暴露研究，评估人群长期风险，并探索橡胶添加剂的安全替代方案。
