《European Journal of Medicinal Chemistry》：Fulfilling Multiple Roles in PROTAC Design: The Emerging Potential of Oligonucleotides
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编者推荐： 本综述系统性地总结了寡核苷酸在靶向蛋白质降解（TPD）策略，特别是蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）设计中的多功能角色。文章不仅回顾了寡核苷酸作为转录因子等“不可成药”靶点的蛋白质配体（POI ligand）的广泛应用，还前瞻性地探讨了其作为连接体（linker）和E3连接酶配体（E3 ligase ligand）的新兴潜力。综述深入分析了包括oligoTRAFTAC、O‘PROTAC、TF-PROTAC等在内的多种创新平台，并详细阐述了其结构-活性关系（SAR）、递送挑战和未来发展方向，为开发新一代高效、精准的靶向降解疗法提供了全面的视角和重要的参考。
1. 引言
传统的药物发现依赖于设计能够与特定蛋白质靶点结合的小分子，旨在调节其活性并产生治疗效果。这种基于占据驱动的策略对于具有明确活性位点或变构位点的蛋白质（如酶和受体）已被证明有效。然而，在应对缺乏可及性结合口袋或呈现动态复杂结构的靶点时，其局限性显而易见。人类蛋白质组中约80-85%的疾病相关靶点被认为是“不可成药”的，其中包括转录因子（TF）和支架蛋白等。靶向蛋白降解（TPD）作为一种新兴的治疗替代方案，在过去二十年中应运而生。它基于事件驱动的药理学模式，即治疗效果由特定细胞事件触发，而非对靶点的持续占据或抑制。TPD策略利用内源性蛋白质降解机制，诱导对目标蛋白（POI）的清除或减少。
在这一背景下，蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）已成为主要的TPD策略之一。PROTAC是异双功能化合物，通常由三个部分组成：一个POI配体、一个连接体和一个E3泛素连接酶配体。其作用机制是将POI与E3连接酶拉近，促进POI的多泛素化，并最终引导其被蛋白酶体降解。目前，大多数PROTAC利用少数几种E3连接酶，如Cereblon（CRBN）和Von Hippel-Lindau（VHL）。
转录因子是“不可成药”靶点中最具代表性的例子之一，因其在细胞分化、免疫应答、代谢和细胞死亡等多种生物过程中的核心作用而备受关注。寡核苷酸诱饵作为合成短链DNA或RNA，能够模拟转录因子的生理性靶序列，从而与之结合并阻止其与内源性靶序列的相互作用。然而，寡核苷酸疗法常面临稳定性差、递送效率低等挑战。将寡核苷酸整合到PROTAC设计中，利用其作为POI配体来靶向转录因子，代表了一种极具前景的策略，可扩大可降解蛋白的范围，并提高降解的效力和特异性。
2. 寡核苷酸作为PROTAC设计中的POI配体
2.1. 寡核苷酸诱饵型PROTAC
利用寡核苷酸与核酸结合蛋白（如转录因子）天然的高亲和力和序列特异性，研究者开发了多种平台，将含有特定结合序列的寡核苷酸诱饵与E3连接酶配体连接，以实现对“不可成药”蛋白的靶向降解。
2.1.1. TRAFTACs与oligoTRAFTACs平台
Samarasinghe等人（2021）开发了靶向降解转录因子的TRAnscription Factor TArgeting Chimeras（TRAFTACs）技术。该技术利用嵌合寡核苷酸，其一端是与目标转录因子（TOI）结合的DNA序列，另一端是能结合融合蛋白dCas9-HaloTag7（dCas9HT7）的CRISPR RNA（crRNA）部分。随后，加入HaloPROTAC分子招募VHL-E3连接酶至复合体附近，从而实现TOI的泛素化和降解。该技术成功降解了NF-κB和brachyury，但需要共递送嵌合寡核苷酸和dCas9HT7融合蛋白，限制了其治疗应用。为此，第二代TRAFTACs，即“oligoTRAFTACs”应运而生。这是一种单组分方法，仅使用连接了E3连接酶招募小分子配体（如VHL配体）的寡核苷酸序列。研究表明，oligoTRAFTACs能在细胞系和斑马鱼体内有效降解c-Myc和brachyury，且降解活性受VHL配体在寡核苷酸上的位置、连接体长度和寡核苷酸骨架化学性质（如硫代磷酸酯修饰可提高稳定性和效力）的显著影响。
2.1.2. O‘PROTACs平台
Shao等人（2021）开发了O’PROTACs平台。他们设计了包含转录因子识别双链寡核苷酸的PROTACs，用于靶向降解淋巴增强因子1（LEF1）和ETS相关基因（ERG）。对于LEF1，利用其已知DNA结合序列设计的O‘PROTAC（OP-V1）能有效、剂量依赖性地降低前列腺癌细胞中的LEF1蛋白水平（DC50为25 nM），并抑制β-catenin/LEF1复合体的转录活性。对于ERG，含有泊马度胺（CRBN配体）的O’PROTAC（ERG OP-C-N1）展现了有效的降解能力（DC50为182.4 nM）。这些结果凸显了目标特异性对E3连接酶/连接体选择的要求。
2.1.3. TF-PROTACs平台
Liu等人（2021）同期报道了类似的概念，命名为TF-PROTACs。他们开发了靶向NF-κB和E2F的TF-PROTACs。针对NF-κB，使用形成发夹结构的单链DNA寡核苷酸，通过Strain-Promoted Azide–Alkyne Cycloaddition（SPAAC）反应连接VH032（VHL配体）来合成化合物。研究发现，含有聚乙二醇（PEG）连接体的变体降解p65蛋白的效果最佳。该平台也成功应用于降解另一个转录因子E2F1，证明了其通用性。此外，Zhu等人（2025）设计了针对尤文肉瘤驱动因子ETV6的TF-PROTACs，使用（GGAA）3微卫星重复序列作为诱饵。选择性ETV6降解导致已知的EWS::FLI1靶基因上调，从而引起细胞应激和DNA损伤，并使尤文肉瘤细胞对标准化疗药物敏感。
2.1.4. STAT3诱饵型PROTACs
Shih等人（2023）开发了基于STAT3特异性双链诱饵寡核苷酸（hSIE序列）的PROTACs，连接了不同的E3连接酶配体（IAP、VHL、CRBN）。其中，连接泊马度胺（CRBN配体）的POM-STAT3展现出最强的STAT3降解活性（DC50~261 nM），而连接VHL或IAP配体的变体效果较弱或无活性。Hall等人（2024）进一步设计了细胞选择性的STAT3降解剂。他们将STAT3特异性诱饵与泊马度胺连接，并进一步与CpG寡核苷酸偶联，创建了C-STAT3DPROTAC。CpG序列是Toll样受体9（TLR9）的配体，TLR9在特定免疫细胞（如B细胞）和一些癌细胞上表达，从而实现了对TLR9阳性细胞（如A20 B细胞淋巴瘤）的选择性靶向和STAT3降解。
2.1.5. ERα诱饵型PROTACs
Naganuma等人（2022）开发了靶向雌激素受体α（ERα）的寡核苷酸诱饵PROTACs。他们将稳定的双链诱饵（ER(dec)）与不同的E3连接酶配体（LCL161、VH032、泊马度胺）偶联。其中，连接IAP配体LCL161的LCL-ER(dec)降解ERα的效果最强。后续研究（2023年）通过引入硫代磷酸酯（PS）修饰和发夹结构，提高了寡核苷酸的核酸酶抗性和细胞摄取能力，从而增强了降解活性，但也观察到PS修饰可能影响靶点选择性。Ohaka等人则通过将ERα PROTAC与疏水性细胞穿透肽（CPP）和异源双链寡核苷酸（HDO）结合，创建了CPP/HDO-PROTAC，实现了在不使用转染试剂条件下的细胞摄取和ERα降解。
2.1.6. c-Myc诱饵型PROTACs
Ai等人（2024）设计了基于优化c-Myc结合序列（E-box基序）的寡核苷酸PROTACs（MP-16和MP-17），用于治疗肝细胞癌。他们发现，与CRBN/来那度胺系列相比，连接VHL/VH032配体的化合物能有效降解c-Myc，其中短连接体设计（MP-16和MP-17）活性最佳。突变E-box基序则完全丧失了降解活性，证实了序列特异性结合的关键作用。MP-16和MP-17在体外能有效抑制肝癌细胞增殖，在体内经纳米颗粒封装递送后也能抑制肿瘤生长。
2.1.7. RNA-PROTACs
Ghidini等人（2021）开发了靶向RNA结合蛋白（RBP）的RNA-PROTACs。他们以Lin28A为概念验证靶点，使用其保守的7核苷酸结合序列作为配体，并连接了源自HIF-1α蛋白的VHL招募肽段（LA[Hyp]YI）。通过引入PS和2‘-O-甲氧乙基（MOE）修饰提高稳定性。结果表明，RNA-PROTACs能与Lin28A结合，介导其泛素化和蛋白酶体降解。该策略也成功应用于其他RBP，如RBFOX1，证明了其通用性。
2.2. 适配体型PROTACs
适配体是能够以高亲和力和特异性结合靶标的单链DNA或RNA寡核苷酸，具有免疫原性低、毒性小的优点。
2.2.1. AS1411为基础的PROTACs
AS1411是一种富含鸟嘌呤、能形成G-四链体结构的DNA适配体，可特异性结合在多种肿瘤细胞表面过表达的核仁蛋白（NCL）。Zhang等人和Chen等人分别报道了将AS1411与VHL或CRBN配体连接，构建了能够选择性降解NCL的PROTACs（如ZL216、dNCL#T1），并在体外和体内显示出抗肿瘤活性。此外，研究发现NCL能与E3连接酶MDM2结合。Fu等人利用这一特性，开发了ANM-PROTACs平台，将AS1411作为MDM2的“招募器”，与不同靶蛋白（如STAT3、c-Myc、AR-V7、p53-R175H）的配体连接，实现了对这些“不可成药”癌蛋白的肿瘤选择性降解。Wang等人则利用AS1411分别与VHL配体连接（AS1411-VH032）或两个AS1411分子自连接（homoAS1411），实现了对MDM2的靶向降解，并稳定了p53。Fu等人还将AS1411与靶向VEGF165的适配体V7t1连接，构建了能选择性降解VEGF165的双适配体PROTACs（AS1411-V7t1和V7t1-AS1411），在肿瘤和血管内皮细胞中抑制血管生成和肿瘤生长。
2.2.2. 靶向p53-R175H的适配体型PROTACs
Kong等人（2022）报道了首个选择性靶向p53-R175H热点突变的PROTAC。他们利用一种能选择性结合p53-R175H的RNA适配体（p53m-RA），与CRBN配体（沙利度胺衍生物）连接，构建了降解剂dp53m-RA。该分子能在表达p53-R175H的细胞中诱导剂量和时间依赖性的降解。为解决RNA适配体血清稳定性差的问题，后续研究（2023年）通过分子对接指导的SELEX后优化，开发了具有更高稳定性和亲和力的DNA适配体变体p53m-DA，并合成了相应的PROTAC dp53m。dp53m在多种携带p53-R175H突变的癌细胞系中诱导了该突变体的选择性降解，并抑制了细胞增殖、迁移和肿瘤生长，且与顺铂具有协同作用。
2.2.3. 靶向c-Myc的适配体型PROTACs
Wang等人利用高通量筛选技术（微波孔板SELEX）鉴定了c-Myc特异性适配体MA9C1，并将其与泊马度胺连接构建了PROTAC ProMyc。ProMyc在纳摩尔浓度下（DC50为5.02 nM）即可有效降解多种癌细胞中的c-Myc，并抑制癌细胞增殖和迁移。为提高成药性，他们进一步设计了第二代嵌合体circPA1-ProMyc，通过环化提高稳定性，并整合了靶向PD-L1的适配体以实现肿瘤靶向递送和双靶点（c-Myc和PD-L1）降解。
2.2.4. C-PROTAC平台
Huang等人开发了共价PROTAC（C-PROTAC）用于降解Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）。他们通过SELEX筛选出ZBP1特异性DNA适配体（Z3），并将其与可共价结合靶标的N-酰基-N-烷基磺酰胺（NASA）以及VHL配体结合。与非共价PROTAC相比，C-PROTAC对ZBP1的降解效率提高了三倍以上（DC50= 25.69 nM）。在H1N1流感病毒感染模型中，C-PROTAC能有效抑制病毒诱导的ZBP1表达和细胞坏死，提高细胞活力，并显著降低促炎细胞因子水平。在小鼠模型中，C-PROTAC治疗提高了生存率，改善了体重，并减轻了肺部炎症。
3. 寡核苷酸作为PROTAC设计中的连接体
除了作为靶点配体，寡核苷酸的结构特性也被用于优化PROTAC的连接体设计。Li等人开发了一种多价PROTAC（AS-TD2-PRO），使用DNA四面体作为刚性支架连接多个功能模块：一个AS1411适配体用于肿瘤靶向，两个STAT3诱饵作为识别模块，以及一个VHL配体。这种刚性的DNA四面体结构能够更精确地控制靶蛋白与E3连接酶之间的空间关系，从而提高了STAT3的降解效率和肿瘤特异性。Zheng等人（2025）则提出了DNA模板化空间可控的PROTACs（DTACs）概念，将E3连接酶配体和POI配体整合到DNA双链支架上。这种设计允许精确调控两个配体之间的距离和取向，并以周期蛋白D1-CDK4/6复合物为模型证明，降解效率取决于配体间的距离和方向，为理性设计高效PROTAC提供了新工具。
4. 寡核苷酸作为PROTAC设计中的E3连接酶配体
Yang等人拓展了可用于PROTAC设计的E3泛素连接酶库。他们通过磁珠SELEX技术筛选出能特异性结合Cullin 2-RING E3泛素连接酶复合物底物受体ZYG11B的适配体Apt#Z6。利用此适配体，他们开发了ZYG11B适配体型PROTACs（ZATACs），成功降解了包括NCL、SOX2和p53-R175H在内的多种靶蛋白。为进一步解决递送问题，他们构建了基于DNA三向连接（3WJ）的ZATACs（3WJ-ZATACs），通过整合额外的肿瘤靶向适配体（如靶向NCL的AS1411），实现了无需转染试剂的肿瘤特异性摄取，并在体内显示出强大的抗肿瘤活性。
5. 寡核苷酸基PROTAC的合成策略
寡核苷酸基PROTAC的合成通常涉及将E3连接酶配体与核酸“弹头”连接。最常用的方法包括固相合成和点击化学。寡核苷酸链本身通常通过标准的亚磷酰胺固相合成法制备，该过程在自动合成仪上于固相载体（如可控孔玻璃）上进行，经过脱保护、偶联、封端和氧化四个步骤的循环。最后从固相载体上切割并进行全局去保护，得到全长的寡核苷酸。随后，通过铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）或SPAAC等生物正交反应，将含有叠氮或炔基修饰的E3连接酶配体与已合成的寡核苷酸进行连接。部分双链或双适配体PROTACs（如homoAS1411或AS1411-V7t1）则可通过将两条分别带有不同功能域的修饰DNA链进行退火来构建，其间使用短的poly(A)/poly(T)连接体，以保持G-四链体等天然二级结构。
