NO（一氧化氮）在通过PDE4/cAMP信号通路维持气道平滑肌收缩力方面起着关键作用

《Experimental Cell Research》：NONO is essential in maintaining airway smooth muscle contractility through PDE4/cAMP signaling pathways

本研究通过构建NONO基因敲除小鼠模型，发现NONO通过调控PDE4/cAMP信号通路及肌球蛋白轻链激酶（MLCK）活性影响气道平滑肌收缩力，为哮喘等气道疾病治疗提供新靶点。

　　

方晓敏|牛雅|胡丹|张秀娟|张瑞刚

中国湛江广东医科大学基础医学院生理学系

摘要

非POU结构域含有的八聚体结合蛋白（NONO）是一种多功能核蛋白，在调节转录和剪接等核过程方面发挥着重要作用。然而，NONO在调节气道平滑肌（ASM）收缩中的作用仍很大程度上未知。在本研究中，我们旨在阐明NONO对ASM收缩的影响及其潜在机制。通过使用NONO基因敲除（NONO K.O.）小鼠，我们利用机械记录系统检测了气管的收缩能力。通过实时PCR定量了PDE4的表达水平，通过ELISA测定了IP₃、钙调蛋白、cAMP、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和磷酸化MLC（p-MLC）的含量。结果表明，与非野生型（W.T.）相比，NONO K.O.小鼠的ASM收缩能力显著下降；PDE抑制剂IBMX和PDE4抑制剂rolipram显著减轻了NONO K.O.小鼠的ASM收缩减弱现象。NONO K.O.小鼠中PDE4A-C mRNA的表达上调，而cAMP、钙调蛋白和IP₃的基础水平下降。此外，在卡巴胆碱（CCh）刺激后，收缩装置的两个重要成分MLCK和p-MLC也有所减少。这些数据表明，NONO至少部分通过PDE4/cAMP信号通路调节ASM收缩，为ASM收缩提供了一个新的调控靶点。

引言

NONO在真核生物的细胞核中广泛表达，是一种多功能RNA/DNA结合蛋白[1]。NONO的功能包括DNA解旋和修复、基因转录调控以及mRNA剪接[1, 2]。此外，NONO被认为是cAMP信号通路的一个组成部分[3, 4]，并在气道平滑肌张力调节中发挥重要作用[5, 6]。然而，NONO对ASM收缩的影响仍不清楚。

ASM是导致气道狭窄的主要因素，而ASM收缩失调（如气道高反应性（AHR）是哮喘等气道疾病的一个特征[7]。ASM张力通常由MLCK调节，MLCK的磷酸化可受到上游调节因子如IP₃/Ca²⁺和cAMP/PKA的影响[8, 9]。

平滑肌收缩由钙信号激活[10]，而PKA活性可以调节这一过程[11, 13]。另一方面，激动剂（如支气管扩张剂）刺激导致的cAMP水平升高会引起ASM松弛[6]。cAMP的水平受PDEs的调节[14]。据报道，PDE4抑制剂能够调节ASM的功能，如支气管扩张和细胞因子释放[15, 16]。在人类肾上腺皮质细胞中，NONO参与PDE转录本的剪接和降解[17]。因此，本研究旨在探讨NONO在ASM收缩中的作用，重点关注PDE4/cAMP信号通路。

试剂和检测试剂盒

卡巴胆碱、吲哚美辛、IBMX和rolipram购自Tocris和GlpBio。cAMP、α-SMA、钙调蛋白、IP₃、MLCK和p-MLC的水平通过市售试剂盒（Mlbio，上海，中国）进行检测

动物

NONO K.O. C57BL/6小鼠由Cyagen Biosciences Co., Ltd.（中国苏州）提供。本研究使用了8至10周大的雄性C57BL/6小鼠。小鼠的饲养方法如前文所述[18]。所有动物实验均经过审查并获得批准

NONO K.O.小鼠气管中的ASM收缩能力下降

通过连续给予卡巴胆碱并测量等张张力来确定ASM收缩能力（图1A）。结果显示，与非野生型（W.T.）相比，NONO K.O.组的ASM收缩能力显著下降（图1B）。为了排除ASM收缩能力差异可能是由于表型变化引起的，我们量化了α-SMA（平滑肌细胞的标志物）的水平，发现两组之间没有显著差异（图1C）。

NONO K.O.小鼠中ASM收缩能力的下降依赖于PDE4

一个

讨论

在本研究中，我们观察到NONO缺乏会导致ASM收缩能力减弱，这一现象可以通过PDE4抑制剂得到缓解。NONO K.O.小鼠气管中的PDE4基因表达上调，而cAMP水平下降。此外，钙信号分子如钙调蛋白和IP₃也减少。最后，以MLCK和p-MLC水平为指标的收缩装置在NONO K.O.小鼠中的表达显著低于野生型。这些发现表明NONO基因在ASM收缩调节中起着重要作用

结论

本研究探讨了NONO在调节ASM收缩中的作用及其潜在机制，证实NONO至少部分通过PDE4/cAMP信号通路对维持ASM收缩能力至关重要。

作者贡献声明

牛雅：研究工作。方晓敏：研究工作、数据分析。张瑞刚：写作、审稿与编辑、初稿撰写、项目监督。张秀娟：资源准备。胡丹：资源支持

数据和材料的可用性

所有相关数据和资源均可在文章中找到。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

资金支持

本研究得到了中国国家自然科学基金（82000008）的支持，该基金由张瑞刚博士获得。

利益冲突声明

所有合作者均声明没有利益冲突