《Free Radical Biology and Medicine》：Nrf2 regulates monocyte/macrophage recruitment during initial stages of neointimal formation after vascular injury
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血管损伤后Nrf2系统通过调控MCP-1介导的巨噬细胞趋化与黏附影响血管重塑，Nrf2缺乏加剧炎症反应与氧化应激，骨髓移植实验证实Nrf2对巨噬细胞招募的关键作用。
足野隆（Takashi Ashino）| 山本雅之（Masayuki Yamamoto）| 数泽智（Satoshi Numazawa）
昭和医科大学药学院毒理学系，日本东京品川区畑野台1-5-8，邮编142-8555
摘要
血管损伤后，单核细胞/巨噬细胞的募集及其在内膜区域的黏附会引发动脉粥样硬化及随后的血管闭塞性疾病。Nrf2系统作为氧化应激反应的关键转录调节因子，在血管损伤和动脉粥样硬化的各个阶段均发挥作用。然而，其在新生内膜扩张初期单核细胞/巨噬细胞募集和黏附中的功能意义仍不明确。本研究发现，在小鼠机械性动脉损伤后7天内，Nrf2在位于内膜区域的巨噬细胞（F4/80+）中高度表达。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）作为单核细胞/巨噬细胞聚集的强效介质，可促进Nrf2向细胞核的转运，并诱导包括血红素加氧酶-1和硫氧还蛋白-1在内的目标基因的表达。Nrf2缺陷会增强MCP-1刺激的巨噬细胞趋化性及活性氧的产生。在体内实验中，Nrf2缺陷（Nrf2?/?）小鼠的血管损伤后单核细胞向内膜区域的募集和黏附现象更为显著。将野生型（WT）骨髓细胞移植到Nrf2?/?小鼠体内可抑制巨噬细胞的募集和黏附，而将Nrf2?/?骨髓细胞移植到WT小鼠体内则会产生相反的效果。因此，Nrf2系统可能调节新生内膜损伤后血管重塑初期的单核细胞/巨噬细胞募集过程。
引言
在血管损伤修复过程中，循环中的炎症细胞（主要是单核细胞）首先被募集并黏附到内膜区域。黏附的单核细胞分化为巨噬细胞，后者分泌多种趋化因子、细胞因子和生长因子[1]。这一过程促进了血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖和迁移，从而导致血管重塑。在血管重塑过程中，正常水平的活性氧（ROS），包括超氧阴离子和过氧化氢，作为细胞内信号分子参与生理修复过程。相反，损伤修复过程中ROS的异常调控会损害血管细胞功能，引发新生内膜增生，最终导致动脉粥样硬化和经皮血管重建后的再狭窄等血管闭塞性疾病。
生理水平的ROS在生长因子和趋化因子的调控下，可促进细胞的分化、迁移、黏附和增殖[2]。在趋化性和迁移反应中，活性氧在损伤部位活跃迁移的细胞中积累；这种积累对于细胞骨架重组和血管内皮生长因子刺激的内皮细胞迁移至关重要[3]。活性氧通过激活信号通路，增强血小板衍生生长因子-β（PDGF-β）诱导的VSMC迁移[4]。在THP-1单核细胞中，过氧化氢可增强对C-C趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/CCL2）的反应性趋化性[5]。因此，活性氧也像内皮细胞和VSMCs一样，作为单核细胞/巨噬细胞迁移的关键信号分子[6]。
MCP-1有助于激活并募集来自骨髓的单核细胞/巨噬细胞至损伤部位，从而支持体内的局部炎症反应[7]、[8]。血管损伤后，VSMCs、血管内皮细胞和成纤维细胞会表达MCP-1，促使单核细胞黏附于损伤部位，随后发生血管重塑[9]、[10]。MCP-1在多种与动脉粥样硬化相关的病理条件下高表达，包括人类动脉粥样硬化病变、摄入高胆固醇饮食的灵长类动物的动脉组织，以及暴露于轻微修饰脂质的血管内皮细胞和VSMCs[11]。多项研究还将MCP-1与氧化应激联系起来。缺乏MCP-1的小鼠产生的与氧化应激相关的分子（如肝内ROS和4-羟基壬醛）较少[12]。不稳定型心绞痛患者的单核细胞/巨噬细胞中MCP-1水平升高，导致氧化应激增加[13]。因此，越来越多的证据表明MCP-1和ROS均参与了动脉粥样硬化的发生。
虽然生理水平的ROS对生物活动至关重要，但过量的ROS会导致氧化损伤和细胞功能障碍，需要多种抗氧化机制来严格调控细胞的氧化还原平衡。核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）是生物防御系统的关键组成部分，它是细胞对抗氧化应激反应的主要调节因子；该蛋白可上调参与解毒和抗氧化防御的基因[14]。在氧化应激下，Nrf2转运至细胞核，与小Maf蛋白形成异二聚体，并与ARE结合，从而激活II期解毒酶和抗氧化蛋白（如血红素加氧酶-1和硫氧还蛋白-1）的表达[15]。Nrf2在维持血管稳态中的作用已被广泛报道。氧化应激诱导物（如ROS或脂质过氧化物酶）以及血流剪切应力可激活内皮细胞中的Nrf2；活化的Nrf2通过其靶抗氧化基因发挥抗动脉粥样硬化作用[16]。血管损伤后，Nrf2/Keap1系统通过抑制VSMCs的异常增殖和迁移来抑制新生内膜增生，而VSMCs是血管壁的重要组成部分[17]、[18]。因此，Nrf2可能在调节动脉粥样硬化的发展中发挥作用。然而，Nrf2在血管损伤后MCP-1诱导的单核细胞/巨噬细胞募集和黏附过程中的直接作用仍不明确。基于这些背景，我们假设Nrf2系统在血管损伤后新生内膜形成初期单核细胞/巨噬细胞募集过程中起关键作用。本研究利用Nrf2缺陷（Nrf2?/?）小鼠探讨了Nrf2在单核细胞/巨噬细胞对MCP-1的趋化性反应及损伤后募集中的作用。
材料
重组人MCP-1购自Peprotech（新泽西州罗基山）。抗Nrf2（D1Z9C，用于免疫印迹）、抗Txn1（C63C6）和抗泛肌动蛋白（D18C11）抗体购自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州丹弗斯）。抗Nrf2（C-20，用于免疫荧光）和抗Rb（C-2，核标记物）抗体购自Santa Cruz Biotechnology（加利福尼亚州圣克鲁斯）。抗Hmox1抗体（SPA-895）购自Enzo Life Sciences（纽约州法明代尔），抗F4/80抗体（A3-1）
Nrf2在
血管损伤后内膜病变中的黏附巨噬细胞
单核细胞/巨噬细胞的募集和黏附可引发血管外向重塑和内膜增厚，进而导致动脉粥样硬化的发生。为了检测体内血管损伤后血管重塑初期巨噬细胞中的Nrf2表达，我们使用抗Nrf2和F4/80（小鼠巨噬细胞标记物）抗体进行了免疫染色。虽然损伤后7天在损伤的血管壁中检测到F4/80阳性细胞，
讨论
血管闭塞性疾病（如动脉粥样硬化）源于血管损伤后内膜（血管最内层）的异常增生。过量的ROS诱导的氧化应激会引发多种血管细胞功能障碍，促进动脉粥样硬化的发生和发展。氧化应激影响新生内膜的形成及随后的动脉粥样硬化过程，包括细胞的激活和增殖
CRediT作者贡献声明
数泽智（Satoshi Numazawa）：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理。山本雅之（Masayuki Yamamoto）：撰写 – 审稿与编辑、资源提供。足野隆（Takashi Ashino）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计、资金申请、数据分析、数据整理、概念构思
利益冲突声明
作者声明没有可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了
JSPS KAKENHI项目的支持，项目编号分别为15K19398（资助给T.A.）、18K08115（资助给T.A.）和24K14706（资助给T.A.）。作者感谢Enago（
www.enago.jp）提供的英语语言审稿服务。
