基于计算机模拟的PCR抑制机制预测，以及利用细菌产生的EPS（胞外多糖）介导的钙纳米颗粒作为PCR促进剂，以实现高效的法医DNA分析

《Human Gene》：In-silico prediction of PCR inhibition mechanism and exploitation of bacterial EPS mediated calcium nanoparticles as PCR facilitator for efficient forensic DNA analysis

针对DNA提取中化学抑制剂对PCR的影响，本研究通过计算化学分析发现Proteinase-K抑制最强，随后为Chloroform、Phenol等。实验验证了EPS-Ca NPs复合物可将CYCLO基因扩增效率提升至1.61-4.02倍，并实现23个STR标记的同步扩增，显著改善抑制问题。

作者：Hirak Ranjan Dash、Kamayani Vajpayee、Dnyaneshwar Tanpure、Mithilesh Kumar Mishra、Ritesh Shukla、Braja Kishore Mohapatra、Surajit Das

印度新德里110085，国家法医学科学大学法医学科学学院

摘要

常规法医DNA分析结果受到用于抑制潜在PCR抑制剂策略的显著影响。本研究探讨了利用细菌胞外聚合物（EPS）与钙纳米颗粒的组合来减轻常规DNA提取化学物质对DNA分析的影响，从而成功生成DNA图谱。计算机模拟分析显示，蛋白酶K（-871.2 kCal/mol）对Taq DNA聚合酶的抑制作用最为显著，其次是氯仿（-5.2 kCal/mol）、苯酚（-4.5 kCal/mol）、SDS（-4.1 kCal/mol）、乙醇（-3.2 kCal/mol）和EDTA（-2.6 kCal/mol）。实验表明，150–200纳米的针状钙纳米颗粒与EPS（1 mg/ml）的组合在存在这些抑制剂的情况下显著提升了PCR过程的效率。该配方使得CYCLO基因的扩增效率比单独使用抑制剂时提高了1.61–4.02倍。此外，即使在抑制剂存在的情况下，该配方也能同时扩增23个常染色体STR标记。该配方能够有效去除化学污染物，并生成具有高位点间平衡的完整DNA图谱。因此，EPS+钙纳米颗粒配方被认为适用于减轻法医生物样本DNA提取过程中化学物质的污染。

引言

在过去几十年中，法医DNA分析在设备、检测方法和应用方面取得了显著进展。分析方式已从基于长度的常染色体、Y染色体和X染色体STR标记分析转变为利用下一代测序（NGS）技术进行基于序列的SNP标记分析（Dash等人，2021年）。线粒体DNA的HV1、HV2和HV3区域测序以及全线粒体DNA测序在法医DNA分析中显示出重要作用（Amorim等人，2019年）。Taq聚合酶依赖的PCR过程是所有这些分析中最关键的步骤。然而，Taq聚合酶极易受到许多化学物质的抑制，这些化学物质会限制其活性，最终导致无法获得理想的结果（Ogunkanmi等人，2008年）。由于法医生物样本中天然存在Taq聚合酶抑制剂，这类问题更为常见，许多研究报道了多种影响Taq聚合酶的PCR抑制剂，例如血红蛋白、腐殖酸、肌红蛋白、胶原蛋白、黑色素、染料、EDTA和苯酚等（Vajpayee等人，2023年）。 在任何分子生物学实验中，分离出高质量且不含任何PCR抑制剂的DNA至关重要。为了应对PCR抑制剂的问题，已经开发了多种法医DNA提取策略，如基于柱子和磁珠的纯化方法。无论采用哪种DNA纯化技术，在裂解和分离步骤中使用的某些化学物质痕迹也会被一同提取出来。使用低质量的塑料器皿也可能导致抑制剂分子转移到DNA中（Schrader等人，2012年）。Miller等人（1999年）比较了四种纯化方法（基于硅胶的DNA结合、琼脂糖凝胶电泳、醋酸铵沉淀和Sephadex G-200凝胶过滤），发现没有任何一种方法能完全去除所有污染物。另一项研究表明，QIAamp Power Fecal Pro DNA Kit是去除粪便样本中抑制剂的最合适方法（Srirungruang等人，2022年）。尽管基于磁珠（Bordelon等人，2013年）和基于柱子的DNA纯化策略（Kemp等人，2006年）有望减少提取DNA中的抑制剂，但没有一种技术能保证完全去除所有抑制剂。 因此，人们探索了多种策略来提高存在抑制剂分子时的PCR过程效率。多年来，研究了多种纳米材料（如金纳米颗粒、量子点、碳纳米管、氧化石墨烯以及掺杂金纳米颗粒的大分子聚合物）以提高PCR的特异性和效率（Yang等人，2022年）。虽然金和银纳米颗粒被广泛用作PCR促进剂，但Kambli和Kelkar-Mane（2016年）发现Fe?O?纳米颗粒（扩增效率为190%）比银纳米颗粒（45%）和金纳米颗粒（134%）更具成本效益。此外，还研究了牛血清白蛋白（BSA）、甜菜碱和gp32等大分子作为潜在的PCR促进剂（Al-Soud和R?dstr?m，2000年）；然而，它们与PCR抑制剂的相互作用效率尚未得到充分研究。据我们所知，目前还没有研究分析过微生物生物活性化合物作为PCR促进剂的效率。 大多数法医DNA实验室仍首选基于蛋白酶K/SDS的细胞裂解方法，随后采用有机方法提取DNA。这些化学物质可能会与DNA分子一同被提取出来，从而对后续处理产生不利影响。因此，本研究旨在通过计算机模拟分析了解常规DNA提取化学物质对Taq DNA聚合酶的影响，并评估基于细菌胞外聚合物（EPS）的纳米颗粒配方在存在抑制剂化合物情况下对PCR过程的促进作用。这项研究对于预测PCR抑制机制以及减轻潜在抑制剂的影响具有重要的实际意义。

部分内容

蛋白质和配体结构检索及分子对接

本研究涉及的多种蛋白质和配体的3D结构是从蛋白质数据库（PDB）和PubChem中获取的（表1）。所有配体均使用AutoDock Vina分别与受体进行对接。蛋白酶K和受体分别使用cluspro 2.0（一个自动化的基于网络的蛋白质结构计算对接程序）进行对接。所有配体的对接结果以3D格式在Pymol 3.0中可视化。

计算机模拟预测相互作用机制

计算机模拟揭示了Taq DNA聚合酶与测试化学物质之间可能的相互作用机制（图1）。Taq DNA聚合酶中可能参与相互作用的氨基酸位于图2和表2中。

结论

常规法医DNA分析结果受到用于抑制潜在PCR抑制剂策略的显著影响。本研究探讨了利用细菌胞外聚合物（EPS）与钙纳米颗粒的组合来减轻常规DNA提取化学物质对DNA分析的影响。计算机模拟分析显示，蛋白酶K（-871.2 kCal/mol）对Taq DNA聚合酶的抑制作用最为显著，其次是氯仿（-5.2 kCal/mol）、苯酚（-4.5 kCal/mol）等。

潜在利益冲突披露

无。

涉及人类参与者和/或动物的研究

本研究使用了人类尸体的骨骼。所有实验均遵循世界医学协会的伦理准则（赫尔辛基宣言）进行。

作者贡献声明

Hirak Ranjan Dash：撰写、审稿与编辑、原始草稿撰写、研究概念构思。 Kamayani Vajpayee：方法学设计、研究实施。 Dnyaneshwar Tanpure：方法学设计、研究实施。 Mithilesh Kumar Mishra：方法学设计、研究实施。 Ritesh Shukla：撰写、审稿与编辑、原始草稿撰写、研究监督。 Braja Kishore Mohapatra：撰写、审稿与编辑、原始草稿撰写、方法学设计。 Surajit Das：撰写、审稿与编辑、研究监督。

知情同意

已获得同意。

伦理批准

本研究已获得机构伦理委员会NFSU_DC/1101/FS-Biology/IHEC-2022-23-4的批准。

资金情况

本研究未获得外部资助。

利益冲突声明

全体作者声明不存在任何利益冲突。

致谢

作者衷心感谢国家法医学科学大学校长及德里校区主任为研究工作提供的支持。该研究成果已于2025年6月25日获得印度专利，专利号为567852，申请号为202411037764。