《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Microbiota-responsive BmMBF2-11 limits dysbiosis and promotes intestinal immune homeostasis in the silkworm
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肠道菌群稳态调控机制研究：发现BmMBF2-11蛋白通过调节抗菌肽基因表达维持宿主肠道平衡，并揭示人工饲料条件下菌群多样性下降与宿主免疫响应减弱的关联。
何青秀|杨瑞|刘华为|朱焕南|张宇|陈浩|刘青松|黄光成|夏青友|赵平
中国西部种质创制综合科学中心（重庆）科学城，重庆技术创新育种中心，生物科学研究中心，西南大学，重庆400715，中国
摘要
肠道微生物群对昆虫的营养和免疫至关重要，但鳞翅目昆虫宿主如何感知和缓冲微生物波动仍知之甚少。在这里，我们发现了BmMBF2-11，这是一种在Bombyx mori中主要存在于中肠的多蛋白桥接因子2（MBF2）家族蛋白，它是一种能够维持肠道稳态的微生物响应因子。通过对以桑叶为食（MF）、人工饲料为食（AF）以及添加了Enterococcus mundtii的人工饲料（AFE）组的幼虫中肠进行RNA-seq分析，并结合qPCR组织表达分析，我们发现BmMBF2-11在人工饲料引起的菌群失调和多种机会性细菌的口腔感染下显著上调，其表达水平与肠道细菌负荷呈正相关。通过CRISPR/Cas9介导的敲除实验和特异性过表达实验，以及16S rRNA基因测序和感染实验，我们证明BmMBF2-11在桑叶和人工饲料条件下都能限制总细菌负荷，保持α-多样性和肠道菌群结构，并在面对E. mundtii和Staphylococcus sciuri时促进多种抗菌肽基因的可诱导表达。失去BmMBF2-11会加速E. mundtii的扩散，降低细菌清除能力，并降低宿主的存活率。我们的发现表明，BmMBF2-11是一种MBF2结构域蛋白，它将微生物扰动转化为适当的抗菌反应，从而有助于维持Bombyx mori的肠道微生物群稳态。
引言
昆虫肠道内栖息着具有复杂分类组成的多样微生物群，这些微生物群对宿主的营养、发育、免疫反应和生态适应有重要影响（Gu等人，2024；Jang和Kikuchi，2020；Malacrino，2022；Zhang等人，2023）。这些微生物群的组成和功能受到宿主遗传、饮食和环境暴露的影响，反过来又通过提供代谢物、调节上皮细胞更新和调控先天免疫途径来影响宿主生理（Douglas，2015；Engel和Moran，2013）。当这种动态平衡被打破，即发生肠道菌群失调时，肠道屏障功能会受损，对病原体的易感性会增加，多种与适应性相关的特征也会发生变化。这表明肠道免疫稳态不仅对病原体控制至关重要，也是维持稳定共生肠道微生物群的关键（Motta等人，2018；Raymann等人，2017）。
家蚕Bombyx mori不仅是重要的经济昆虫，也是研究鳞翅目昆虫宿主-微生物相互作用的经典模型（Chen等人，2018a；Dong等人，2018）。独立于培养条件的研究表明，尽管家蚕肠道微生物群的整体结构相对简单，但在不同发育阶段和饲养条件下仍表现出明显的多样性和动态变化（Chen等人，2018a；Dong等人，2018；Qin等人，2022）。比较分析表明，与以桑叶为食的幼虫相比，以人工饲料为食的幼虫通常细菌多样性较低，菌群结构较为简单，生长迟缓和疾病爆发的风险更高，这通常伴随着肠道中Enterococcus和Weissella等机会性菌属的过度生长（Chen等人，2024；Qin等人，2022；Wang等人，2024）。最近的研究进一步表明，补充益生菌或特定饮食成分可以部分恢复人工饲养家蚕的肠道微生物群复杂性并改善其表现，这突显了饮食、肠道微生物群和宿主健康之间的紧密联系（Shu等人，2023；Wang等人，2024）。
为了在肠道中维持共生与致病性之间的动态平衡，昆虫依赖于一套保守的先天免疫途径和上皮防御系统。在Drosophila中，IMD途径由识别肽聚糖的PGRP家族蛋白激活，从而激活NF-κB家族转录因子并诱导多种抗菌肽（AMPs）的产生，如Drosocin和Metchnikowin。适配蛋白FADD对于有效传递革兰氏阴性细菌引发的信号至关重要（Bosco-Drayon等人，2012；Choe等人，2005；Naitza等人，2002）。同时，效应模块如Duox介导的活性氧（ROS）的产生和分泌的溶菌酶与AMPs共同作用，有效限制肠道细菌负荷并防止与年龄相关的菌群失调（Lee等人，2018；Marra等人，2021；Tafesh-Edwards和Eleftherianos，2023）。在B. mori中，包括Toll/IMD信号通路和Duox–ROS系统在内的核心防御模块在序列和功能水平上高度保守，且已直接证明Duox依赖的ROS反应参与了幼虫中肠稳态的微生物群依赖性调节（Shu等人，2023）。然而，与双翅目模型昆虫相比，关于鳞翅目昆虫的上皮细胞如何利用特定的转录调节因子整合微生物信号并精细调节肠道免疫输出的了解还非常有限。
多蛋白桥接因子2（MBF2）最初在B. mori中被发现为一种转录共激活因子，它与核受体FTZ-F1合作调节ftz基因的表达（Li等人，1997；Li等人，1994）。随后的全基因组分析揭示了B. mori中存在一个包含九个成员的MBF2基因家族。比较搜索和系统发育分析表明，基于现有的基因组数据，MBF2结构域蛋白目前仅在昆虫中被描述，并且与REPAT基因家族密切相关（Liu等人，2000；Zhou等人，2016）。这些MBF2家族基因表现出广泛的但组织特异性的表达模式，并受发育阶段和营养状态的调控。它们在Bacillus bombysepticus感染和饥饿压力下显著上调，表明它们可能位于连接免疫和营养代谢的关键调控节点（Zhou等人，2016）。最近在易感或几乎等基因型的抗核多角体病毒B. mori菌株之间的比较转录组分析中发现了MBF2-10，这种MBF2家族成员在细胞中的过表达可以抑制病毒复制，直接将MBF2蛋白与抗病毒防御联系起来（Chen等人，2019）。这些发现支持MBF2家族成员可以在特定背景下作为转录共激活因子发挥作用，并可能有助于将环境和微生物信号与免疫效应输出的控制联系起来，在鳞翅目昆虫中尤其重要。
尽管人们对这一基因家族的兴趣日益增加，但目前仍没有直接证据表明任何MBF2蛋白能够调节B. mori的肠道上皮免疫或肠道微生物群稳态。在人工饲料饲养条件下，这种知识空白尤为重要，因为饮食相关的菌群失调和机会性细菌感染仍然是家蚕生产的主要瓶颈（Chen等人，2024；Qin等人，2022；Shu等人，2023；Wang等人，2024）。先前的研究表明，Duox–ROS系统和经典的Toll/IMD通路有助于B. mori的肠道防御（Liu等人，2025；Shu等人，2023）。然而，尚不清楚宿主特别是在早期微生物生态波动而非明显感染期间，如何利用转录调节网络来持续且成比例地精细调节AMP的表达。鉴于MBF2蛋白作为转录共调节因子并且会在病原体挑战下显著上调（Chen等人，2019；Zhou等人，2016），它们可能是动态调整肠道免疫反应的“设定点”和“增益”的理想候选者。
在这项研究中，我们鉴定出了B. mori基因KWMTBOMO12071，并将其命名为BmMBF2-11。我们发现BmMBF2-11是一种在幼虫中肠中高度富集表达的MBF2家族成员，在微生物扰动和菌群失调时在中肠中迅速上调。系统发育和结构域分析表明BmMBF2-11是一种在Lepidoptera中保守的MBF2结构域蛋白，其序列特征使其与先前报道的MBF2同源物不同（Zhou等人，2016）。此外，通过CRISPR/Cas9介导的敲除、转基因过表达、16S rRNA基因测序以及使用从家蚕中肠分离的机会性细菌进行的口腔感染实验，我们证明BmMBF2-11可以限制总细菌负荷，维持肠道微生物群的α-多样性和菌群结构，并促进多种中肠AMP基因的可诱导表达。通过将MBF2结构域蛋白与肠道免疫稳态功能联系起来，这项研究提供了新的机制见解，揭示了鳞翅目昆虫如何将肠道微生物波动转化为适当的抗菌反应，并表明BmMBF2-11可能是改善家蚕健康管理的有前景的分子靶点。
实验模型
Bombyx mori（多化性N4品系）来自西南大学生物科学中心，在25 ± 1 °C下、12小时光照/黑暗周期的条件下饲养。幼虫以新鲜桑叶或按先前描述的方法制备的人工饲料为食（Qin等人，2022）。无菌饲养步骤如下：在清洁的层流工作台上，用3%甲醛处理卵5分钟，用无菌水冲洗三次，然后用75%乙醇处理2分钟，
BmMBF2-11对家蚕肠道稳态的扰动响应
先前的研究表明，与以桑叶为食的幼虫（MF）相比，以人工饲料为食的幼虫（AF）更容易出现肠道微生物群失调（Dong等人，2018；Qin等人，2022）。为了确定宿主肠道免疫系统如何维持微生物稳态并感知微生物挑战，我们对以桑叶为食（MF）、以人工饲料为食（AF）以及添加了Enterococcus mundtii的人工饲料（AFE）的幼虫中肠进行了RNA-seq分析（图1A）。主成分分析（PCA）显示各处理组之间存在明显的分离，组间方差超过
讨论
本研究系统地研究了MBF2家族蛋白BmMBF2-11在调节家蚕肠道稳态中的作用。我们发现BmMBF2-11在不同饲养条件下是一个重要的宿主因子，它可以限制细菌的过度生长，帮助维持肠道微生物多样性，并增强抗菌肽反应。结合先前关于昆虫肠道微生物群的研究，我们的结果支持昆虫肠道微生物在营养
CRediT作者贡献声明
杨瑞：验证、调查、正式分析。何青秀：写作 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、监督、软件、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。黄光成：正式分析。刘青松：监督、数据管理。赵平：写作 – 审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念化。夏青友：写作 – 审稿与
致谢
我们感谢所有参与这项研究的参与者。本工作得到了以下资金的支持：国家自然科学基金（项目编号32030103 和 32570592）；国家重点研发计划（项目编号2022YFD1201600）；重庆技术创新与应用发展计划（CSTB2024TIAD-KPX0026）。
