综合虚拟与实证筛选方法，鉴定用于降低耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）致病性的多靶点黄酮类化合物——槲皮素-3-O-葡萄糖苷

《International Journal of Antimicrobial Agents》：Integrative Virtual and Empirical Screening to Identify Multi-Target Flavonoid Quercetin-3-O-glucuronide for Reducing MRSA Pathogenicity

抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）的天然黄酮类化合物青蒿素-3-O-葡萄糖苷（Q3G）通过靶向抑制sortase A（SrtA）和ClpP蛋白酶，显著削弱其毒力因子活性，包括抑制粘附、入侵、生物膜形成及毒素分泌，在动物模型中提升生存率，且不诱导细菌死亡从而避免耐药性演化，为新型抗菌药物开发提供新策略。

　　

高尚|王莉|傅泽泽|孙云|王荣|刘全|高飞|关继宇|朱亮|张多多|赵一成

中国长春吉林大学第一医院骨科手术中心骨与关节外科

摘要

天然黄酮类化合物槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Q3G）已被证明是一种有效的抗毒力剂，能够对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），在不影响细菌生长的情况下有效中和其致病性。Q3G针对MRSA菌株USA300中的毒力调节因子Sortase A（SrtA）和酪蛋白水解肽酶P（ClpP），其抑制活性IC₅₀值分别为10.64 μg/mL和7.11 μg/mL。这种双重抑制作用通过阻断细菌与宿主细胞的黏附、侵入及生物膜形成来破坏MRSA的毒力。它还能抑制关键的毒力表型，包括毒素分泌（Hla、pvl）、溶血活性、尿素酶功能以及毒力基因的表达。结构分析证实Q3G可直接与SrtA和ClpP结合，确定了对其抑制作用至关重要的残基。体内实验验证表明，Q3G具有显著的治疗效果：40 mg/kg的剂量可使蜡虫模型小鼠的存活率提高10%至70%，肺炎模型小鼠的存活率提高0%至50%，同时减少皮肤损伤和细菌负荷（30%）。通过选择性地清除MRSA而非直接诱导细菌死亡，Q3G规避了推动抗生素耐药性的进化压力。这种多靶点抗毒力策略提高了治疗效果，为多重耐药性感染提供了可持续的解决方案，使Q3G成为下一代抗菌药物开发的先驱候选物。

引言

金黄色葡萄球菌是一种广泛存在的病原体，可引起从轻微皮肤问题到严重疾病（如败血症和肺炎）等多种人类感染。尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的流行，使得临床管理变得越来越困难[[1], [2], [3]]。MRSA已成为全球医疗相关和社区获得性感染的主要致病菌。其对β-内酰胺类及其他抗生素的耐药性凸显了迫切需要新的治疗手段。近年来，多重耐药菌株已成为临床面临的关键挑战，这强调了开发同时针对细菌毒力和耐药机制的创新疗法的必要性。除了基因耐药性外，金黄色葡萄球菌的表型适应性也使其能够在恶劣环境中持续存在。在某些压力条件下（如接触抗生素或毒力基因表达受到抑制时），金黄色葡萄球菌会转变为小菌落变异型（SCV）。SCV的特点是生长缓慢、代谢活动减弱，并对抗生素和宿主免疫反应具有更强的耐受性[4]。这种表型转变有助于细菌在细胞内存活并引发慢性感染，进一步复杂化了治疗过程。

金黄色葡萄球菌的致病性主要归因于其多样的毒力因子。其中，表面锚定蛋白（如纤维连接蛋白结合蛋白FnBPs）和α-溶血素[5]毒素在细菌黏附、侵入及免疫逃逸中起关键作用[6,7]。Sortase A（SrtA）是一种将这些毒力因子锚定在细菌细胞壁上的关键酶，从而促进感染的建立和持续[8]。此外，ClpP作为Clp蛋白酶复合体的关键组成部分，参与调节应激反应并维持细菌细胞内的蛋白质质量[9]。ClpP对维持金黄色葡萄球菌的agr群体感应系统正常功能至关重要。抑制ClpP会破坏agr激活所需的蛋白水解调节，导致hla、psmα和spa等受agr调控的毒力基因转录减少[10,11]。这种对agr信号通路的干扰会导致毒力整体减弱，降低致病性。SrtA和ClpP是金黄色葡萄球菌毒力的关键靶点，是新型抗菌剂的理想候选对象。

近期研究聚焦于通过靶向SrtA和ClpP来抑制金黄色葡萄球菌感染。SrtA催化表面蛋白与细菌细胞壁的共价结合，这一过程对金黄色葡萄球菌的毒力至关重要。SrtA抑制剂已被证明能破坏细菌黏附和生物膜形成，从而减轻感染严重程度[[12], [13], [14]]。同样，ClpP作为Clp蛋白酶复合体的一部分，参与调节应激反应和蛋白质稳态。抑制ClpP可降低细菌在应激条件下的存活能力并增加其对抗生素的敏感性[9,15,16]。同时抑制SrtA和ClpP可能提供一种全面的方法来破坏金黄色葡萄球菌的毒力并克服耐药机制。同时靶向SrtA和ClpP可以双重抑制MRSA的毒力[17]。通过抑制两条关键途径，可能会产生协同效应，从而提高治疗效果并降低耐药性的发生概率。

传统医学因其在提供新型治疗药物方面的潜力而受到关注。从药用植物中分离出的生物活性成分已被证明对多种细菌感染具有疗效[18,19]。这些化合物通常具有多种作用机制，可以用来针对复杂的细菌过程。传统医学提供了丰富的生物活性分子来源，可能有助于发现新的抗生素或增强现有治疗效果的辅助剂[20]。在这些天然化合物中，黄酮类化合物在对抗MRSA感染方面表现出显著潜力。通过虚拟筛选和实验筛选相结合的方法，我们发现了对SrtA和ClpP都具有亲和力的化合物，最终发现了黄酮类化合物槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Q3G）。Q3G是一种天然存在的黄酮类糖苷，与中国传统药材密切相关。它从几种具有清热解毒、抗菌和抗炎特性的中草药中提取，包括柴胡根（Radix Bupleuri）、大豆种子（Semen Sophorae Japonicae）和忍冬花（Flos Lonicerae Japonicae）。这些草药长期以来一直用于治疗由“热毒”引起的感染，如脓肿、疖子和呼吸道炎症。虽然之前已有报道指出Q3G具有抗氧化、抗黑色素生成[21]、抗阿尔茨海默病[22]和抗炎[23]作用，但其对金黄色葡萄球菌的影响至今尚未得到研究。中医强调一种整体的抗感染策略，不同于单一靶向的抗生素方法。它不是直接杀死病原体，而是同时抑制病原体毒力并增强宿主免疫力，从而恢复体内平衡并促进康复，而不破坏生理平衡。在这一概念框架下，Q3G是一种符合中医“祛邪扶正”原则的生物活性成分，为其低细胞毒性和多靶点调节MRSA毒力的作用提供了科学依据。

本研究采用虚拟筛选和实验筛选相结合的方法，发现了同时对SrtA和ClpP具有抑制作用的化合物。黄酮类化合物Q3G被证明是一种有效的候选物，能够通过破坏关键毒力过程显著降低MRSA的毒力。全面的结构分析和体内模型进一步验证了Q3G的效果，证明其能够显著减轻MRSA感染的严重程度。

部分内容摘要

细菌菌株、试剂和培养条件

实验室中保存了一系列细菌菌株，包括金黄色葡萄球菌（MRSA USA300）及其SrtA敲除突变体（ΔsrtA）和ClpP敲除突变体（ΔclpP）。此外，还构建了携带修饰蛋白表达载体的重组大肠杆菌 BL21（DE3）菌株，分别为pET28a-SrtA和pET28a-ClpP。这些菌株的详细信息见补充表1。所有细菌培养均在37°C下进行。

Q3G作为多重靶点抗毒力剂对抗MRSA的潜力

黄酮类化合物已被证明对细菌和病毒具有显著疗效[[33], [34], [35]]。在本研究中，我们利用DOCKER方法筛选了一组黄酮类化合物库，以识别对ClpP和SrtA具有高亲和力的化合物（图1A）。得分超过120的化合物被列为进一步研究的候选对象（详细信息见补充表S2-S3）。通过组合这些候选化合物，我们确定了五种潜在的有效成分。

讨论

由于MRSA能够迅速发展出对抗标准抗生素疗法的耐药机制，其带来的全球健康负担日益加重，给有效临床管理带来了巨大挑战。这种不断加剧的耐药性不仅使治疗方案复杂化，还常常导致难以控制的持续性严重感染。随着传统抗菌策略效果逐渐减弱，抗毒力方法变得越来越重要

结论

通过虚拟筛选和实验验证，我们证明天然黄酮类化合物Q3G能够有效抑制MRSA的多种毒力因子。Q3G抑制了SrtA和ClpP的活性，并破坏了细菌黏附、生物膜形成、毒素分泌（如Hla和PVL）以及尿素酶活性等关键毒力过程。机制研究证实Q3G能够直接与SrtA和ClpP结合

资助

本项工作得到了吉林省科技发展计划（项目编号：20240207010CX）的支持。

伦理批准

所有动物实验均严格遵循中国《实验动物管理条例》及实验室动物环境和设施要求的规定进行。实验方案得到了吉林大学兽医学院伦理委员会的批准。

序列信息

不适用

作者声明

高尚、王莉和傅泽泽：研究构思与设计。孙云、王荣、朱亮、张多多：数据整理。刘全、高飞、关继宇和赵一成：撰写和初稿准备。最终版本由所有作者共同审定。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。

未引用的参考文献

[51,52]