《International Journal of Biological Macromolecules》：The critical role and catalytic mechanism of pig liver esterase F2 in the hydrolysis of T-2 toxin
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T-2毒素是一种广泛存在于动物饲料中的剧毒真菌毒素，其肝脏水解代谢的主要酶类及关键催化位点机制尚未明确。本研究克隆并表达了猪肝酯酶A1、B9、F1和F2四种异构体，发现F2具有最高的T-2毒素水解效率（Km=0.19mM，Vmax=13.66nmol/min/mg），可将毒素选择性水解为HT-2毒素而不产生其他副产物。通过分子对接和定点突变实验，证实L101、F102和L359这三个氨基酸残基对底物特异性及区域选择性具有决定性作用，突变后既增强HT-2毒素生成又促进副产物新索拉醇（NEO）的形成，其结构变化机制通过晶体建模得到解析。本研究为开发基于猪肝酯酶的毒素生物降解剂提供了理论依据。
李月凯|洪颖|吴家军|关志阳|吴俊|穆培强|严希良|王旭|邓一坤|江俊
中国广东省广州市华南农业大学生命科学学院猪禽育种产业国家重点实验室，邮编510642
摘要
T-2毒素是一种广泛存在于动物饲料中的霉菌毒素，对猪的健康构成严重威胁。肝脏水解是其主要的解毒途径，但参与这一过程的具体羧酯酶同工酶尚未被确定。在本研究中，我们克隆了四种主要的猪肝酯酶——PLEA1、PLEB9、PLEF1和PLEF2，并将其与伴侣蛋白GroEL/ES共同表达在
E. coli Origami?2 (DE3)中。所有重组的PLE酶均表现出对标准底物
-NPA>的水解活性，并能够选择性地将T-2毒素转化为HT-2毒素，且不产生其他产物。其中，PLEF2在最佳条件下显示出最高的水解效率，其Km值为0.19?mM，Vmax值为13.66?nmol/min/mg。分子对接和定点突变实验表明，L101、F102和L359位的丙氨酸替换不仅增强了HT-2毒素的生成，还产生了毒性较低的代谢物neo-solaniol（NEO）。这些发现表明L101、F102和L359位对底物特异性和区域选择性至关重要。结构建模显示，L101A和F102A变体的水解活性增强是由于新形成的进入通道和加强的底物口袋相互作用，而L359A中扩大的结合口袋促进了NEO的形成。这项工作加深了我们对猪体内T-2毒素代谢解毒机制的理解，并确定了一个新的靶点以减轻其毒性。
引言
T-2毒素属于A型镰刀菌烯毒素，主要由Fusarium属真菌产生[1]。该毒素具有天然存在、化学稳定性高和毒性强的特点，是自然污染饲料和食品的主要霉菌毒素之一[2]、[3]。通过抑制蛋白质和DNA合成、诱导细胞凋亡和坏死、干扰能量和脂质代谢以及破坏细胞膜功能和酶活性等方式，T-2毒素会对农场动物和人类的免疫系统、造血系统、神经系统、生殖系统以及肝脏、肠道、皮肤和软骨等组织造成损害[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。在动物体内，T-2毒素主要在肝脏、肠道和肾脏中进行代谢。第一阶段代谢包括水解、羟基化和脱环氧作用，而第二阶段代谢包括葡萄糖醛酸结合[6]、[8]、[9]。在关键的代谢解毒途径中，脱环氧作用和葡萄糖醛酸结合对降低毒性的贡献大于水解作用[10]、[11]、[12]。然而，这些解毒机制仅对HT-2毒素、T-2三醇、T-2四醇和neo-solaniol（NEO）等水解代谢物有效，对完整的T-2毒素无效[8]、[11]。由于后续的解毒步骤依赖于预先的水解反应，因此阐明水解机制并识别相关酶至关重要。
羧酯酶（CES）是一类具有α/β-水解酶结构的多基因家族蛋白[13]。这些酶通过保守的催化三联体（Ser-His-Glu/Asp）催化含有酯键、硫酯键和酰胺键的化合物的水解，这一结构对它们的活性至关重要[14]、[15]。先前的研究已表明，负责水解T-2毒素的酶是羧酯酶[16]、[17]。特别是，通过等电聚焦从大鼠肝微粒体中分离出的等电点（pI）为5.4的酶被证实可以将其水解为HT-2毒素[16]。最近，贾等人报道重组人CES1（hCES1）能够将T-2毒素转化为HT-2毒素，但无法转化为NEO，并且这种水解作用降低了T-2毒素对软骨细胞的毒性[18]。尽管hCES1的晶体结构已被确定，其水解海洛因和可卡因的催化机制也已阐明[19]，但其对T-2毒素的催化机制仍不清楚。
猪肝酯酶（PLE）是一种重要的羧酯酶，在有机合成中广泛用作生物催化剂[20]。它包含多种具有不同对映选择性的同工酶[21]、[22]，迄今为止已鉴定出108种PLE同工酶[23]。约翰森等人报告称，从猪肝中提取的商业PLE能够将T-2毒素水解为HT-2毒素[16]。然而，参与这一过程的关键同工酶尚未确定。PLE同工酶的多样性为研究其催化机制提供了天然的变异库。在本研究中，我们重组表达了四种代表性的PLE同工酶，确定了PLEF2是负责T-2毒素水解的关键同工酶，并阐明了其催化机制。
试剂
T-2毒素、HT-2毒素、neo-solaniol（NEO）、T-2三醇和T-2四醇购自Pribolab（中国青岛）。p-硝基苯乙酸酯（p-NPA）和p-NP（p-硝基苯酚）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州路易斯）。
质粒构建
猪肝酯酶A1（PLEA1）（GenBank编号
X63323）基因从猪肝cDNA中扩增，PLEB9 [23]和PLEF1 [23]同工酶的编码序列也被完全合成。PLEF2同工酶是通过将苯丙氨酸替换为亮氨酸获得的
四种重组PLE蛋白对
-NPA>和T-2毒素具有催化活性
在鉴定出的108种PLE同工酶中，只有19种在通城猪（一种中国地方品种）和大白猪中同时表达，且其表达水平因品种和年龄而异。在这些共表达的同工酶中，PLEA1和PLEB9的含量最高[23]。鉴于PLEF1已被报道对
-NPA（典型的CES底物）具有最高的水解活性[28]，我们假设选择这些酶是因为它们的高表达量（PLEA1和PLEB9）
讨论
T-2毒素是一种常见的饲料污染物，对猪的健康构成严重威胁[30]。水解是其主要的代谢解毒途径，因此识别负责这一过程的酶对于阐明其毒理机制至关重要。我们之前对猪原代肝细胞的转录组和蛋白质组分析显示，在T-2毒素暴露后CES1C4和CES1C5的表达上调[31]。然而，在真核系统中表达时
结论
我们确定PLEF2是负责水解T-2毒素的主要猪肝酯酶。L101、F102和L359位残基对底物特异性和区域选择性至关重要，因为它们的突变改变了代谢产物的组成并调节了催化效率。这些发现加深了我们对猪体内T-2毒素解毒机制的理解，并强调了PLEF2作为减轻霉菌毒素毒性的潜在靶点的重要性。
作者贡献声明
李月凯：撰写初稿、数据可视化、验证、方法学设计、实验研究。洪颖：撰写初稿、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。吴家军：撰写初稿、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。关志阳：实验研究。吴俊：实验研究。穆培强：实验研究。严希良：资源获取。王旭：资源获取。邓一坤：项目监督、项目管理、资金争取。江俊：撰写：
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了Claude 4辅助写作。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。
资助
本工作得到了广东省基础与应用基础研究基金 [2022B1515130003, 2023A1515010155]的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
