GT61基因在海洋硅藻Phaeodactylum tricornutum中调控木聚糖侧链的合成，这一过程受到生物钟的调控

《International Journal of Biological Macromolecules》：The GT61 genes mediating xylan side-chains synthesis in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum under circadian regulation

本研究比较了商用木聚糖酶Viscoferm?在水相缓冲体系与三种天然深共熔溶剂（NADES）中的热稳定性和热力学稳定性。结果表明，所有NADES均显著提高酶的热稳定性，其中Betaine:Glycerol（1:3）体系最有效，酶半衰期延长两个数量级，且热力学分析显示ΔGD?值较高，ΔHD?和ΔSD?值较低，荧光光谱证实酶三级结构保留。该发现为绿色生物催化系统的开发提供了理论支持。

　　

Zafeiria Lemoni|Evanthia Seinti|Styliani Kalantzi|Theopisti Lymperopoulou|Andromachi Tzani|Georgios Stavropoulos|Dimitris G. Hatzinikolaou|Anastasia Detsi|Diomi Mamma

雅典国立技术大学化学工程学院生物技术实验室，Zografou校区，Iroon Polytechniou街9号，15780，雅典，希腊

摘要

在许多工业过程中，酶的结构和功能完整性对温度和pH值非常敏感，这通常会降低效率；因此，需要替代溶剂系统来提供一个稳定的微环境，以在苛刻的工艺条件下维持酶的活性。本研究调查了商业木聚糖酶（Viscoferm?）在选定的天然深共晶溶剂（NADES）中的热稳定性和热力学稳定性，并将其与传统的含水缓冲系统进行了比较。该酶在三种NADES（甜菜碱：甘油（1:3，Bet:Gly）、氯化胆碱：甘油（1:2，ChCl:Gly）和L-脯氨酸：甘油（1:2，Pro:Gly））中分别在六个温度（30–80°C）下进行孵育，每种溶剂都含有20%（w/w）的水作为共溶剂。同时，在与每种NADES对应的pH值的缓冲液中进行了平行测试。计算了动力学参数（k_d、t_1/2、D、z值）和热力学性质（ΔH°D*、ΔG°D*、ΔS°D*），以阐明失活机制和溶剂-酶相互作用。结果表明，在所有NADES中酶的热稳定性得到了提高，而热力学分析显示ΔG°D*值一致较高，ΔH°D*和ΔS°D*值较低，表明酶对热变性的抵抗力增强。荧光光谱结果也支持了这些发现，表明酶的三级结构得到了更好的保留。在各种NADES中，甜菜碱：甘油体系表现出最强的热稳定性。这些发现表明，NADES显著增强了酶的热稳定性，支持将其作为工业生物催化中的绿色和可调介质使用。

引言

工业生物催化需要能够承受恶劣条件的酶，其中热稳定性对于效率和可扩展性尤为重要。鉴于这些要求，当代蛋白质工程研究越来越多地集中在提高酶的稳定性和催化效率、调节pH-活性曲线、提高底物选择性以及增强热稳定性和操作稳定性上[1]。通常评估蛋白质稳定性的两个不同但相互关联的方面是热力学稳定性和动力学稳定性。热力学稳定性（构象稳定性）指的是蛋白质保持其折叠功能构象的能力，而不是转变为展开状态[2]。这种稳定性源于多种因素的复杂相互作用，如氢键、疏水相互作用、范德华力、离子相互作用以及熵效应（分子可能采取的形状数量）和溶剂有序性[3][4]。蛋白质的动力学稳定性（操作稳定性或长期稳定性）是指折叠蛋白质发生不可逆变性（展开）的速率，决定了蛋白质在生理或应力条件下保持其功能构象的时间[5]。热力学稳定性和动力学稳定性都受氨基酸序列中的内在因素（例如疏水核心堆积、氢键网络、二硫键）以及外部环境因素（如温度和pH值）的调控[6]。温度升高会增加分子运动，降低热稳定性并加速展开过程，而pH值的变化会改变残基的质子化状态并破坏对蛋白质稳定性至关重要的静电相互作用[7]。 在这种背景下，天然深共晶溶剂（NADES）等替代溶剂系统因其在热应力下保持酶活性的潜力而受到了广泛关注。NADES是由两种或更多天然存在的成分（如糖类、氨基酸、多元醇等）组成的共晶混合物，这些成分充当氢键供体（HBD）和受体（HBA）。在特定的摩尔比和温度下，这些成分形成熔点远低于各单独成分的共晶混合物。NADES的一个关键优势在于其可调节的物理化学性质，可以通过选择成分及其摩尔比来定制。Choi等人提出，NADES可能在植物细胞内自然形成，作为应对极端环境条件的保护机制，通过强保留残留水分和防止冻结来稳定细胞膜、酶和代谢物[8]。NADES促进了酶与反应物之间的有效分子相互作用，可以调节酶活性、增强构象稳定性并保持结构完整性，同时符合绿色化学的原则[9]。一些研究报告了NADES中酶活性的提高及其对酶热稳定性的影响[10]。 NADES已成功应用于多个领域的酶促过程中，包括制药、食品和生物燃料。例如，用NADES预处理显著提高了生物乙醇生产中木质纤维素材料的酶水解效率。反应性NADES提高了酯化反应中脂肪酶的催化效率和热稳定性，用于合成基于多元醇和碳水化合物的生物表面活性剂。此外，据报道，基于氯化胆碱的NADES既可以用作反应介质，也可以作为过氧化物酶催化反应中的牺牲电子供体，从而实现原位过氧化氢的生成[11]。深入理解酶-NADES相互作用对于优化其在生物催化应用中的性能和推进工业生物工艺至关重要。 本研究旨在调查商业木聚糖酶（Viscoferm?）在三种选定的NADES（甜菜碱：甘油（1:3）、氯化胆碱：甘油（1:2）和L-脯氨酸：甘油（1:2）中的动力学和热力学稳定性，每种溶剂都含有20%（w/w）的水作为共溶剂，并将其与相应pH值的传统含水缓冲系统进行比较。使用商业酶制剂而非纯化形式可以更真实地反映工业条件。通过应用改进的Arrhenius模型，进行了详细的动力学和热力学分析，包括失活能（ΔE°D*）、焓（ΔH°D*）和熵（ΔS°D*）以及吉布斯自由能（ΔG°D*）的测定，以评估酶的热稳定性和热力学稳定性。进一步通过荧光光谱分析了木聚糖酶在NADES中的构象。这些结果为设计基于NADES的稳健生物催化系统提供了有价值的指导。

材料

本研究中使用了Novozymes A/S（丹麦Bagsv?rd）提供的商业酶制剂Viscoferm?。Viscoferm?是一种包含多种非淀粉降解酶的混合物，包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶。选择木聚糖酶作为指示制剂在NADES中稳定性的指标。商业酶制剂中未去除任何辅料或添加剂。由于这些添加剂在配方中的浓度相对较低，因此对其影响较小。

NADES的极性和pH值测定

表2列出了所制备NADES的摩尔转变能（ENR）和pH值。根据Nile Red极性尺度，吸收最大值（λ_max）向更高波长的蓝移表明溶剂的极性增加[13]。本研究中使用的所有NADES的ENR值都高于水，表明它们的极性低于水。然而，它们的ENR值低于乙醇。

结论

本研究对一种商业木聚糖酶在三种含水NADES系统中的动力学和热力学性能进行了全面评估，并与传统的含水缓冲液进行了比较。在所有测试系统中，NADES甜菜碱：甘油（1:3）始终表现出最佳的稳定作用。其适中的极性和微碱性的pH值共同创造了一个能够显著减缓热失活的微环境，在70–80°C下将酶的半衰期延长了两个数量级。

CRediT作者贡献声明

Zafeiria Lemoni：撰写——原始草稿、软件开发、实验研究、数据分析。 Evanthia Seinti：实验研究。 Styliani Kalantzi：实验研究、数据管理。 Theopisti Lymperopoulou：数据验证。 Andromachi Tzani：数据验证。 Georgios Stavropoulos：数据管理。 Dimitris G. Hatzinikolaou：资源提供。 Anastasia Detsi：监督、资源管理、方法论设计、概念构思。 Diomi Mamma：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、方法论设计、概念构思。

资金来源

本研究得到了欧盟的欧洲区域发展基金和希腊国家基金通过“竞争力、创业和创新”运营计划（项目编号：T2EDK-02333、MIS 5131416）的共同资助。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Georgios Stavropoulos与Korres SA存在雇佣关系。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢Novozymes A/S（丹麦）慷慨提供用于本研究的酶制剂。