《International Journal of Biological Macromolecules》：Structural characterization of κ-carrageenan by acetylation modification and its effect on intestinal inflammation
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κ-卡拉胶分子量及乙酰化改性对肠道炎症的影响研究。采用酸水解-超滤法分析不同分子量（6455-5.9 kDa）κ-卡拉胶结构特征及乙酰化衍生物的肠道炎症调控机制，发现分子量降低导致结构松散、硫酸含量减少，乙酰化引入乙酰基并改善表面结构。体外实验表明低分子量κ-卡拉胶促进TNF-α、IL-1β和ICAM-1分泌，破坏紧密连接蛋白（occludin、claudin-1），而乙酰化改性可逆转上述效应，为优化食品添加剂安全性提供依据。
沈世琦|童彩玲|李志鹏|朱彦兵|陶红|倪慧|姜泽东|郑明静
中国福建省厦门市集美大学海洋食品与生物工程学院，邮编361021
摘要
本研究旨在通过酸水解-超滤法探讨不同分子量（约6455–5.9 kDa）的κ-卡拉胶的结构变化及其对肠道炎症的影响。结果表明，随着分子量从约6455 kDa降低到5.9 kDa，κ-卡拉胶的表面结构显著松弛，孔径增大，同时总糖含量减少。乙酰化修饰使κ-卡拉胶表面更加松散，出现粗糙并附着有晶体颗粒，但并未改变单糖组成。乙酰化引入了乙酰基团并降低了卡拉胶中的硫酸盐含量；在FT-IR光谱中乙酰基团的特征峰位于1740 cm?1，在NMR氢谱中位于2.04 ppm。重要的是，酸解后的F-κ-CA促进了Caco-2细胞中TNF-α、IL-1β和ICAM-1的生成，并下调了Ocultdin和Claudin-1等紧密连接蛋白的表达，这种效应在低分子量κ-卡拉胶中更为明显。乙酰化κ-卡拉胶下调了细胞因子（TNF-α、IL-1β和ICAM-1）的表达，并增强了紧密连接蛋白的表达，显示出对肠道上皮细胞炎症反应的明显调控作用，为进一步验证其免疫调节功能奠定了基础。这些结果有助于未来κ-卡拉胶的开发和应用。
引言
人体肠道共生细菌能够消化和降解膳食多糖，产生丁酸等代谢物，这对肠道稳态和免疫力至关重要。例如，来自Asparagus officinalis的多糖已被证明可以改善肠道屏障功能并增加丁酸水平，显示出其在缓解代谢和炎症性疾病方面的潜力[1]。膳食多糖、肠道免疫和微生物群之间的相互作用复杂多样，对整体健康有不同影响[2]。研究表明，肠道微生物群分泌丁酸以抑制HDAC3活性，从而抑制肠道簇细胞的增殖并调节2型免疫反应[3]。膳食多糖可通过促进MUC2和IL-10的分泌以及增加杯状细胞数量来增强肠道黏液屏障，并通过恢复肠道微生物群平衡（如Akkermansia muciniphila、Lactobacillus、Roseburia及其代谢产物短链脂肪酸SCFAs）来修复屏障，从而调节肠道免疫和抗肿瘤活性[4]、[5]。此外，最近的研究强调了营养调节在促进巨噬细胞控制的肠道黏膜愈合方面的潜力，这可能为治疗肠道炎症和黏膜炎提供有希望的策略[6]。
多糖具有复杂多样的结构，主链或分支含有各种糖苷键（如α-或β-(1→3)/(1→4)/(1→5)/(1→6)-糖苷键），由多种单糖组成，有时还带有乙酰化等修饰[7]。由于化学结构的不同，不同的膳食多糖可能被微生物群酶解，从而影响特定肠道微生物群的生长和相关代谢产物的产生，进而对健康产生不同影响[8]、[9]、[10]。例如，富含单糖的成分比其他膳食多糖更能有效改善肠道屏障[11]。此外，多糖的乙酰化修饰具有更好的功能，因为乙酰化多糖的分子量分布更均匀，能更好地保持高级结构（如螺旋结构），使其适用于需要维持特定构象的应用。例如，乙酰化的魔芋葡甘露聚糖和Dendrobium officinale多糖显著促进了SCFAs和丁酸的生成，调节了肠道环境并促进了肠道健康；这归因于乙酰基团增强了溶解性和生物活性[12]。然而，乙酰化修饰多糖及其微生物群衍生代谢物的肠道免疫调节作用仍需进一步研究。
海藻富含天然多糖[13]。卡拉胶（也称为Chondrus ocellatus或Eucheuma denticulatum胶）是一种从海藻中提取的典型线性硫酸化多糖。作为一种常见的食品添加剂，它广泛用于乳制品、肉制品和方便食品中，具有增稠、凝胶化和稳定作用。此外，卡拉胶还具有优异的生物活性，如预防高脂血症、抗炎、调节肠道菌群结构[14]、[15]、[16]。然而，一些研究表明，低分子量的卡拉胶在消化和发酵过程中容易降解，这会促进促炎因子TNF的分泌和ICAM-1的上调，减少Lactobacillus的数量，改变肠道微生物群，降低肠道上皮细胞的黏液屏障厚度，并促进肠道炎症[17]、[18]。这种低分子量的κ-卡拉胶可能导致肠道细胞凋亡，破坏肠道上皮细胞层的完整性，引发肠道免疫失调，从而引发炎症，使其在食品工业中的应用存在很大争议，并引起了社会的广泛关注[19]、[20]。因此，其在食品工业中的应用仍存在很大争议。欧盟食品添加剂法规（EU）第231/2012号（E407卡拉胶）明确规定：卡拉胶是一种未经水解/化学降解的聚合物，对低分子量尾部的限制（LMT，<50 kDa）为≤5%（按质量计），以降低潜在风险；而美国食品药品监督管理局（FDA）允许其在良好生产规范范围内使用，但要求明确标注。相比之下，一些国家甚至出于对特殊群体肠道敏感性的考虑，限制了卡拉胶在婴幼儿食品中的添加。由于缺乏对分子量和其他结构特征如何调节肠道免疫反应的清晰理解，目前无法为优化其在食品工业中的应用提供科学依据，从而限制了针对提高卡拉胶安全性的定向修饰策略的发展。解决这一争议对于平衡卡拉胶的工业价值和食品安全至关重要，这也突显了本研究的必要性和实际意义。
如上所述，将乙酰基引入多糖可以显著改变其理化性质和生物活性，如增强免疫反应[21]。乙酰化多糖通过促进INOS和TNF-α的表达来增强免疫反应性，诱导细胞质IκBα的降解，并抑制LPS诱导的核内p65和磷酸化p38 NF-κB的表达，从而抑制炎症[22]。乙酰化通过暴露羟基和拉伸糖链来改变卡拉胶的空间结构，从而提高淋巴细胞和巨噬细胞的免疫反应性，并促进巨噬细胞的吞噬作用，改善免疫反应[23]。这些研究表明，乙酰化修饰可能是减轻低分子量κ-卡拉胶引起的肠炎的有效策略。
因此，本研究通过酸解法制备了不同分子量的κ-卡拉胶，并确定了这些κ-卡拉胶及其乙酰化衍生物的结构变化及其对肠道炎症的调节作用。结构分析采用了高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）、傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）、气相色谱-质谱（GC–MS）、高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）和核磁共振光谱（NMR）。此外，通过体外Caco-2细胞模型研究了κ-卡拉胶及其乙酰化衍生物对肠道炎症的调节作用，并讨论了结构特征（分子量、乙酰基）变化与其对肠道炎症调节作用之间的关系。这些结果为研究κ-卡拉胶结构和诱导肠道炎症的活性提供了理论基础，并为避免与肠道免疫失调相关的卡拉胶安全问题提供了方法。
材料
κ-卡拉胶（LV-R-03；批号：21050109）购自福建乐新食品有限公司（中国福建）。Caco-2细胞由中国科学院干细胞银行（中国上海）提供。所用试剂包括无水乙酸、甲酰胺、浓盐酸、氢氧化钠（片状）、N、N-二甲酰胺、吡啶、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、半乳糖、无水乙醇、DNS、甲醇、硫酸钾、果糖、间苯二酚、D-葡萄糖醛酸、咔唑等。
κ-卡拉胶及其乙酰化衍生物的化学表征
κ-卡拉胶及其乙酰化衍生物的化学组成见表1。与κ-卡拉胶相比，酸解后产生了降解的κ-卡拉胶片段，总糖含量逐渐减少，还原糖和硫酸根自由基的含量增加（
p < 0.05）；这表明κ-卡拉胶的整体结构在酸解过程中受损，部分多糖降解。
结论
本文制备了不同分子量和乙酰化程度的κ-卡拉胶，以探讨κ-卡拉胶的结构与其肠道炎症之间的内在关联。随着分子量的降低（从6455.24 kDa降至5.90 kDa），κ-卡拉胶的总糖含量减少，硫酸盐含量增加，表面结构显著松弛。这种低分子量的κ-卡拉胶促进了TNF-α、IL-1β的释放。
作者贡献声明
沈世琦：撰写——初稿，实验研究。童彩玲：撰写——审阅与编辑，数据分析。李志鹏：数据分析，概念构思。朱彦兵：数据分析，概念构思。陶红：验证，数据分析。倪慧：撰写——审阅与编辑，概念构思。姜泽东：撰写——审阅与编辑，概念构思。郑明静：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号32001713）的支持，同时得到了福建省自然科学青年基金（项目编号2024J09041）、福建省科学技术厅（项目编号2023Y4009）、集美大学优秀青年发展计划（项目编号ZQCY2025005）以及福建省科技经济一体化服务平台项目（项目编号B21022）的部分支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
