《International Journal of Biological Macromolecules》：Stress-dependent interfacial competition with direct binding enhances IgG4 stabilization
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本研究通过等温滴定热力学（ITC）、临界胶束浓度（CMC）测定及多应力模型（轨道摇动、涡旋应力、冻融循环），揭示了多糖表面活性剂（Tween 20/80）与普朗克180（P188）对IgG4单抗的应力依赖性稳定机制差异。多糖表面活性剂在温和热力学控制应力下通过界面吸附稳定抗体，但需超CMC浓度（4×CMC）在剧烈动力学控制的涡旋应力中实现动态单体储备的全面保护；而P188仅能提供有限稳定，因其吸附动力学较慢。研究建立了连接蛋白-表面活性剂相互作用机制与制剂设计的理论框架，推动从经验筛选向机制指导的稳定剂选配范式转变。
颜高|吴恒倩|王莉莉|张嘉星|刘敏|丁壮|王正平|高凌峰|周二鹏|韩俊
济南大学化学与化学工程学院，中国济南 250000
摘要
本研究阐明了非离子表面活性剂（聚山梨酯20/80）和聚氧乙烯醚188（P188）对IgG4单克隆抗体（mAbs）的应力依赖性稳定机制。IgG4是一种在临床上具有重要意义的单克隆抗体亚类，具有独特的结构脆弱性。为了探究这些机制，我们采用了一种多方法结合的研究方法，包括等温滴定量热法（ITC）、临界胶束浓度（CMC）测定以及包含轨道振动、涡流应力及冻融循环的多应力模型。实验结果表明，聚山梨酯通过熵驱动的疏水相互作用与IgG4结合，而P188则未观察到此类相互作用。在温和的热力学控制应力下，当这两种表面活性剂的浓度达到各自的CMC时，它们都能通过可饱和的界面吸附来稳定蛋白质，尽管它们的CMC值存在显著差异（聚山梨酯20/80远低于P188）。相比之下，在强烈的动力学控制涡流应力下，它们的作用机制有所不同：聚山梨酯需要超过CMC的浓度（4×CMC）才能作为动态单体库并提供全面保护，而P188由于其较慢的吸附动力学，仅能提供有限的稳定作用。这些发现表明IgG4的稳定机制受到不同的应力依赖性因素调控。这一研究框架直接将蛋白质-表面活性剂的基本相互作用与合理的配方设计联系起来，促进了从经验筛选向基于机制的稳定剂选择的转变。
引言
mAbs是一类重要的生物制药，用于治疗多种疾病[1],[2]。然而，它们的治疗潜力常常受到蛋白质固有不稳定性的影响，在生产、储存和运输过程中，聚集是最常见的降解途径[3],[4]。在引发聚集的众多应力中，界面不稳定性尤为重要。生产与运输过程中遇到的机械应力（如搅拌和振动）会不断产生气液界面，这些界面成为蛋白质吸附、展开和聚集的热点[5],[6]。同样，冻融过程会形成冰液界面，再加上冷冻浓缩效应、pH值变化和离子强度变化，共同形成一系列不稳定的条件[7],[8],[9]。这些事件可能导致不可见或可见颗粒的形成，从而可能影响药物的安全性和有效性[10],[11]。
非离子表面活性剂是单克隆抗体的关键配方成分，在商业产品中得到广泛应用[12]。相比之下，离子表面活性剂（阴离子或阳离子）很少用于批准的药物配方中，因为它们与抗体表面的带电残基之间的静电相互作用可能引发蛋白质聚集，从而影响产品的安全性和有效性。在非离子表面活性剂中，聚山梨酯（Tween 20/80）仍然是商业配方中的主流选择，而P188由于其卓越的化学稳定性而成为有吸引力的替代品[13],[14],[15]。这些表面活性剂主要通过界面竞争发挥作用，尽管直接结合和胶束包裹也可能对其整体效果有所贡献[16],[17]。基础研究与工业实践之间存在明显差距：虽然学术研究表明聚山梨酯在低于CMC的浓度下也能提供保护[18]，但在实际生产中通常采用高于CMC的浓度。此外，聚山梨酯和P188的分子结构不同（见图1），这导致它们在不同应力条件下的结合亲和力和行为存在差异[19],[20]。然而，关于应力强度如何调控其稳定机制之间的转变（即在温和应力下从热力学平衡到强烈应力下的动力学竞争的转变）仍是一个关键的知识空白。
作为一种临床上重要的抗体亚类，IgG4具有独特的结构特征，使其成为研究界面稳定机制的理想模型，尤其是与IgG1等亚类相比[23]。其接近中性的等电点（pI约为6.9），远低于IgG1的等电点（pI约为8.5），这减少了界面上的静电排斥，增加了其吸附和聚集的倾向，从而对稳定剂的要求更高[24],[25],[26]。此外，IgG4的Fc域具有内在的灵活性，这使得在应力作用下疏水区域的暴露更加明显，而其他亚类的Fc结构则较为刚性[27]。IgG4表面疏水区域的独特分布调节了表面活性剂的结合位点和相互作用热力学，从而能够精确阐明其稳定机制[28]。综上所述，这些特性使得IgG4对界面应力更为敏感，便于进行严格的稳定剂筛选，并清晰区分不同的作用模式（如直接结合和界面竞争）。然而，专门针对这一亚类的系统研究仍然有限。
为填补这一空白，我们采用了一种综合的、基于机制的研究方法。利用聚山梨酯和P188作为分子探针，通过ITC量化了它们与IgG4的直接相互作用，并通过CMC测定研究了它们的自组装行为。我们使用了一个区分性的应力模型，包括轨道振动和冻融（热力学控制）与强烈涡流应力（动力学控制）来模拟相关的加工应力。稳定效果通过尺寸排阻色谱（SEC）、动态光散射（DLS）和浊度（OD???）进行评估。这种方法不仅能够比较不同稳定剂的保护效果，更重要的是，能够揭示应力强度如何动态调节稳定机制。本研究为IgG4配方中表面活性剂的合理选择提供了一个预测性的、基于机制的框架。
材料
mAb由华兰基因工程有限公司（中国新乡）提供。IgG4的理论等电点（pI）约为6.9。Tween 20和Tween 80购自Well Pharmaceutical Technology（中国南京），P188购自Merck KGaA（德国达姆施塔特）。除非另有说明，所有实验均在蛋白质浓度为4.68 mg/mL、10 mM醋酸钠缓冲液（pH 5.0）的条件下进行。所有缓冲液成分均为分析级。
结合能力
表面活性剂与IgG4之间的相互作用通过ITC进行研究，该方法提供了关键的热力学参数，包括结合常数（Ka）、化学计量比（N）、结合焓（ΔH）和熵（ΔS）。如图2所示，Tween 20和Tween 80的滴定曲线显示出特异性结合的特征：每次注入都会产生一个明显的放热峰，随着抗体结合位点的逐渐饱和，峰高逐渐降低。
结论
本研究证实，非离子表面活性剂对IgG4单克隆抗体的界面稳定遵循不同的应力依赖性机制，明确了聚山梨酯和P188之间的功能差异。因此，P188作为一种化学性质稳定的辅料，适用于长期储存；而聚山梨酯则更适合高剪切力的生产过程。需要指出的是，本研究仅关注了单个表面活性剂；在实际配方中，
作者贡献声明
颜高：撰写初稿、可视化处理、数据验证、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。吴恒倩：实验研究、数据整理。王莉莉：实验研究、数据分析。张嘉星：数据验证、数据分析。刘敏：数据验证、方法学设计。丁壮：撰写、审稿与编辑、数据分析。王正平：资源协调、项目管理。高凌峰：资源协调、项目管理。周二鹏：实验研究、概念构建。韩俊：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
