精氨酸根据溶液条件的不同，既可以抑制也可以促进蛋清蛋白质的聚集

《International Journal of Biological Macromolecules》：Arginine can either suppress or promote the aggregation of egg white proteins depending on solution conditions

盐浓度与缓冲液电荷影响精氨酸对卵清蛋白热聚集的双向调控作用

　　

中村拓海 | 野本彰 | 富田淳介 | 浦田智人 | 白木健太郎

日本茨城县筑波市天之台1-1-1，筑波大学纯粹与应用科学研究所，邮编305-8573

摘要

蛋清蛋白（EWPs）表现出复杂的聚集行为，这种行为会随着溶液条件（如pH值）的不同而变化。尽管精氨酸（Arg）通常被用作广谱聚集抑制剂，但已有研究表明它也可能促进聚集，而这种双重作用的机制仍不清楚。在本研究中，我们探讨了作为添加剂添加的精氨酸在不同溶液条件下如何影响EWPs的热聚集。在较高盐浓度下，精氨酸抑制了热聚集；而在低盐浓度下则促进了聚集。此外，N-乙酰精氨酸（Ac-Arg）即使在低盐条件下也能显著抑制5 mg/mL的EWPs的聚集。EWPs的聚集反应还强烈依赖于缓冲液的净电荷。总体而言，这些发现表明精氨酸根据盐浓度和缓冲液电荷的不同，既可作为盐类物质也可作为聚集抑制剂发挥作用。这项研究有助于更好地理解精氨酸在食品和药物配方中影响蛋白质聚集的条件。

引言

蛋清蛋白（EWPs）是一种成本效益高且富含蛋白质的营养资源[1]。由于其出色的起泡和凝胶化特性，它们在食品工业中被广泛使用，并长期以来一直受到食品科学和技术的关注[2][3][4]。最近的蛋白质组学分析显示，EWPs包含超过150种不同的蛋白质[5]。由于这些蛋白质的等电点（pI）范围广泛，EWPs表现出受静电和疏水相互作用共同影响的复杂聚集行为[6]。EWPs的聚集可以由多种物理化学因素触发，包括pH值变化[3]、热处理[7][8]、高压[9]、超声波处理[10]和机械搅拌[11]。在食品加工中，控制热聚集至关重要，因为它决定了产品的质地并优化了灭菌过程。热处理可以诱导EWPs的构象变化，从而降低致敏性[12]，但同时也可能在杀灭沙门氏菌过程中产生不必要的聚集物，从而降低功能性[13]。虽然作为EWPs主要成分之一的溶菌酶已被广泛研究[14][15][16]，但它是一种碱性（pI约为11.0）的球状蛋白质，具有独特的物理化学特性，因此其聚集行为与整个EWPs混合物明显不同。

蛋白质在水溶液中的分散性和聚集行为在很大程度上取决于存在的盐的类型和浓度[17]。解离的离子在蛋白质表面形成电双层，产生静电屏蔽效应[18]。即使在大约10 mM的盐浓度下，也能观察到这种屏蔽效应[19]。这一现象可以通过基于蛋白质pI与溶液pH值关系的两个简化案例来说明：(i) 在无离子溶液中，当pH值接近pI时，范德华力起主导作用，导致蛋白质聚集；(ii) 当pH值与pI不同时，蛋白质由于静电排斥而保持分散状态，但加入超过大约10 mM的盐会增强静电屏蔽作用并促进聚集[21]。这种在低盐条件下的聚集行为可以用Derjaguin–Landau–Verwey–Overbeek（DLVO）理论来描述[22]。然而，在较高盐浓度下，DLVO理论无法完全解释蛋白质聚集[23][24][25]。一个著名的例子是Hofmeister效应，它在高盐浓度（约500 mM或以上）下观察到[26]。等渗离子稳定了蛋白质的天然结构，但增强了疏水相互作用，从而通过盐析效应导致聚集[27]。相反，变性离子会破坏蛋白质并削弱疏水相互作用，产生抑制聚集的盐溶入效应[27][28]。因此，在低盐浓度下静电相互作用占主导地位，而在高盐浓度下则受离子特异性效应的影响[29]。

精氨酸（Arg）是一种分子量为174.2 Da的碱性氨基酸，pI约为10.8。在已知的聚集抑制剂中[30]，精氨酸被广泛使用，因为它可以在不破坏蛋白质天然三级结构的情况下抑制聚集[31]，使其成为一种广泛应用的可添加物质[7][32][33][34][35][36]。精氨酸的聚集抑制作用主要来自两种相互作用：(i) 精氨酸的胍基与芳香残基之间的阳离子-π相互作用[37]，以及(ii) 其亚甲基与疏水蛋白质残基之间的疏水相互作用[38]。然而，这些效应通常只在相对较高的精氨酸浓度（约200 mM）下观察到[39][40]。只有当有足够的精氨酸分子存在时，这些相互作用才能显著抑制聚集。尽管高浓度的精氨酸已被证明可以抑制EWPs的聚集[7]，但那项研究使用的溶液中含有10 mM的MgCl2，而镁离子可能会强烈影响蛋白质的行为。为了阐明精氨酸如何本质上抑制聚集并扩展其应用范围，有必要在低盐条件下研究其效果，在这种条件下添加的盐的影响最小。

先前的研究已经考察了在特定溶液条件下蛋清蛋白（EWPs）的热聚集情况。Iwashita等人建立了含盐（包括10 mM MgCl2）条件下EWPs聚集的实验条件，为后续研究提供了基础[8]。在类似条件下，Hong等人报告称ArgHCl可以抑制EWPs的聚集[7]。相反，其他研究则描述了精氨酸对不同蛋白质系统的聚集促进作用[41][42]。这些观察结果表明，精氨酸对蛋白质聚集的影响可能对溶液条件（包括盐浓度和组成以及缓冲液性质）非常敏感，而对于像EWPs这样的复杂蛋白质混合物，这些条件尚未进行系统比较。

在食品科学和药物科学中，进行低盐条件下的研究对于开发低盐食品[43]和评估配方中的蛋白质稳定性[44]非常重要。然而，大多数先前的低盐条件研究都集中在纯化的单组分蛋白质上[45][46]，对多组分系统（如EWPs）中的聚集控制了解有限。在这里，我们研究了作为添加剂的精氨酸在极低盐浓度下对EWPs热聚集的影响。实验条件的设计旨在作为一种强应力下的机制探针，而不是直接模拟特定的工业过程。在这些条件下，我们发现了精氨酸的两种不同作用模式：(i) 在低浓度下占主导地位的静电屏蔽作用，以及(ii) 已知能抑制聚集的特定分子相互作用。虽然当前的结果提供了关于精氨酸如何调节复杂蛋白质系统中聚集的见解，但将其直接外推到更温和或工业相关的条件时应谨慎。这些发现主要为使用精氨酸作为聚集抑制剂时优化溶液条件提供了机制基础。

材料

材料

干鸡蛋白（EWPs，K型）来自Kewpie Egg Corporation（日本东京）。六水合氯化镁（MgCl2）、L(+)-盐酸精氨酸（ArgHCl）、L(+)-盐酸赖氨酸（LysHCl）、L(+)-谷氨酸一氢钠盐一水合物（NaGlu）和二硫苏糖醇（DTT）来自FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.（日本大阪）。氯化钠（NaCl）、甘氨酸（Gly）和无水磷酸二氢钠（Na2PO4）来自Kanto Chemical Co.

精氨酸对蛋清蛋白热聚集的添加效应

使用分子量截断值为3500 Da的膜对EWPs进行透析，以去除所有低分子量成分。然后将所得溶液溶解在50 mM MOPS缓冲液（pH 7.4）中，制备EWPs溶液。利用该溶液，我们在尽量减少小分子和离子影响的条件下研究了添加剂对热聚集的影响。图1展示了在600 mM氨基酸存在下的蛋白质浓度依赖性热聚集曲线。

精氨酸双重行为的静电机制基础

精氨酸（Arg）被广泛认为是一种多功能的蛋白质聚集抑制剂[7][40][58][59]。然而，也有报道指出精氨酸在某些情况下会促进聚集[41][42][60][61][62]，这似乎是一个矛盾。在本研究中，我们在低盐条件下制备了蛋白质溶液，并证明这种双重行为可以通过精氨酸的两种性质来解释：其离子特性和内在的聚集抑制性质。图10

结论

本研究表明，精氨酸对EWPs的热聚集具有双重效应，这种效应受盐浓度、缓冲液类型和精氨酸浓度等溶液参数的控制。此外，Ac-Arg在低盐条件下有效抑制了聚集，可能成为控制蛋白质聚集的宝贵添加剂。总体而言，这些发现强调了在评估精氨酸效果时仔细考虑溶液条件的重要性。

作者贡献声明

中村拓海：撰写——初稿、可视化、验证、方法论、研究、概念化。野本彰：撰写——审阅与编辑、方法论、概念化。富田淳介：撰写——审阅与编辑、方法论。浦田智人：撰写——审阅与编辑、概念化。白木健太郎：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本手稿过程中使用了生成式AI和AI辅助技术。具体来说，使用了ChatGPT（OpenAI）来辅助语言润色，并提出改进清晰度和可读性的建议。此外，还利用了Enago的英语编辑服务进行专业语言编辑。所有关于内容、数据解释和结论的最终决定均由作者作出。

资金来源

本工作得到了JSPS KAKENHI的资助，资助编号为JP25K21724、JP24K01970和JP24K17833。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。