《Biochemistry》：Proton-Coupled Chromophore and Protein Structural Changes Control Phytochrome Activation
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这篇综述系统揭示了细菌光敏色素Agp1中Meta-Rc中间态的核心作用，阐述了质子迁移如何成为连接发色团结构变化（如D环烯醇化）与舌区（tongue）二级结构转变（从β-折叠/发夹到α-螺旋/卷曲）的关键分子开关。文章论证了质子转移（而非发色团自身构象弛豫）是触发下游功能信号传导的根源。
引言
光敏色素（phytochromes）是存在于真核生物和原核生物中的一类感光受体蛋白，调控植物的光形态建成等生理过程。尽管宿主细胞多样，光敏色素家族成员在结构和机制上具有共性。典型的光敏色素包含两个模块，其中感光核心模块（PCM）由PAS、GAF结构域和光敏色素特有的PHY结构域组成，并含有一个线性甲川桥连的四吡咯发色团。该发色团在吸收光后，在两种母体状态——Pr和Pfr之间切换。
光激活的基本反应机制在所有光敏色素中非常相似：始于发色团C-D甲川桥的光异构化，随后发生一系列分级构象变化，范围从发色团结合口袋的结构适应，到PHY结构域中一个称为舌区（tongue）的肽段发生二级结构转变。后者触发蛋白质三级和四级结构水平上的进一步变化，并延伸至输出模块（通常携带组氨酸激酶），从而切换其活性状态。从生物物理角度看，光敏色素是结构变化如何在不同时间和长度尺度上转导的典型范例。
材料与方法
本研究使用来自根癌土壤杆菌（Agrobacterium fabrum）的原型光敏色素Agp1，通过红外（IR）差示光谱和共振拉曼（RR）光谱研究了其Pr→Pfr光转换过程。研究采用了低温捕获技术，即在特定温度下启动光转换，该温度被选择为可以阻断热反应序列，从而形成目标中间体。蛋白质表达和纯化如先前所述。IR测量在配备MCT探测器的光谱仪上进行，RR测量则使用傅里叶变换拉曼光谱仪在约80 K下进行。
结果
共振拉曼光谱
光敏色素的RR光谱可分为两个对发色团结构分析特别重要的区域。650至900 cm-1区域包含对甲川桥氢面外坐标（HOOP）有强贡献的振动模式，当甲川桥几何结构偏离平面时，这些模式获得RR活性。其中，790至840 cm-1之间的C-D甲川桥HOOP模式尤为重要，因为它指示了C-D异构化位点的扭曲。
1500至1660 cm-1的光谱区域可用于诊断发色团的质子化状态和整体几何结构。1550至1575 cm-1的中等强度谱带源于B环和C环N-H基团的面内同相弯曲（N–H ip）。这个模式在去质子化的四吡咯中不存在。高于1550 cm-1的剩余谱带归属于三个甲川桥的伸缩模式以及D环的C=C伸缩。
在Agp1中，C-D伸缩的位置从Pr的1627 cm-1变化到Meta-Ra的1621 cm-1，再到Pfr的1599 cm-1。Meta-Rc是一个特例，其N–H ip模式消失，且C=C伸缩区域被几个宽谱带主导，对H/D交换不敏感。这些发现证明B环或C环（或两者）上缺少质子化的氮。
红外差示光谱
Agp1 Pr→Pfr光转换的IR差示光谱反映了蛋白质和发色团相对于Pr的结构变化。光谱在与RR实验中捕获单个中间体相同的温度下测量。
在Lumi-R中，光谱变化仅限于异构化位点和D环C=O基团。这同样适用于后续中间体Meta-Ra。在“Meta-Rc”减去“Pr”的差谱中，我们在酰胺I带区域观察到小的正信号（1623和1658 cm-1）和负信号（1634 cm-1），这指示了舌区从β-折叠/发夹（1634 cm-1）向α-螺旋/卷曲（1623和1658 cm-1）二级结构转变的开始。这一构象变化在向Pfr的最终转变中完成，表现为该区域信号强度的强烈增加。
相比之下，A环和D环的羰基从Lumi-R开始就经历了结构和环境变化。在Meta-Rc中，D环C=O伸缩的正信号不再被观察到，这与Pr的相应负信号形成对比。在Pfr中，D环的C=O伸缩再次出现，但位移至1710 cm-1。
Meta态中的酮-烯醇互变异构
D环的C=O伸缩是四吡咯发色团最强的红外活性模式之一。它在Meta-Rc中的消失意味着该环上羰基官能团的丧失，这只能通过烯醇化来解释。因此，描述所有其他中间态和Pfr光谱结果的酮式结构不适用于Meta-Rc。相反，烯醇互变异构体与IR光谱一致，而Meta-Rc的RR光谱中B环和C环N–H ip弯曲的缺失与去质子化的烯醇化BV结构兼容，该结构同时满足RR和IR的观察结果。
pH依赖的结构变化
我们随后分析了pH变化对Meta-Rc和Pfr结构的影响。在Pfr和Pr中，将pH从7.8降至5.9不会影响IR差示光谱的频率或谱带强度。
相比之下，在Meta-Rc态（250 K）中将pH降至5.0会导致酰胺I区域出现强烈的差示信号，与pH 7.8时的Pfr非常相似。此外，1710 cm-1处的D环C=O伸缩也完全恢复。另一方面，在Pfr态（290 K）中将pH升至12.5时，酰胺I信号以及D环C=O伸缩的正谱带完全消失，光谱变得与Meta-Rc非常相似。这些结果表明，就蛋白质结构和与BV羰基的相互作用而言，Meta-Rc和Pfr可以通过改变pH（在250至290 K的温度范围内）相互转化。
我们通过RR光谱以类似方式研究了pH依赖性，得到了与IR实验相似但不完全相同的图景。在Pfr的情况下，酸性溶液（pH 7.8对比5.8）中的光谱基本保持不变，只有特征标志谱带有2–3 cm-1的微小频率上移。相反，在Meta-Rc态中将pH降至6.0时，出现了可以轻易联系到Pfr的HOOP、N–H ip和C–D伸缩模式的谱带。然而，该光谱并不反映在pH 7.8下捕获的Pfr和Meta-Rc的混合物，因为试图减去其中一种状态的贡献会立即产生假象。因此，该光谱反映了一个不同于Meta-Rc和Pfr的新状态。
将pH向碱性溶液移动对两种状态的光谱有相反的影响。虽然将pH升至12时Meta-Rc光谱保持不变，但在Pfr中我们注意到其特征谱带明显减少，光谱类似于pH 7.8时的Meta-Rc。
讨论
Meta-Rc中的酮-烯醇互变异构
从Meta-Ra到Meta-Rc的转变与从经典酮式到烯醇互变异构体的转变相关。互变异构归因于D环，这是基于IR差示光谱中C=O伸缩模式的归属。此外，质子转移到D环羰基上形成的烯醇互变异构体允许C-D甲川桥的单键和双键特性互换的介观电子分布。这促进了D环的旋转，作为直接热回到初始Pr状态的先决条件。这种Meta-Rc中的捷径反应途径先前已被确定。D环羰基的烯醇化早在几十年前就被提出，但直到最近才在地下光敏色素从Pr到Pfr的热逆反应中记录了该机制的第一个实验证据。Agp1的Meta-Rc的发现代表了第二个例子，因此人们可以考虑烯醇化及随后的甲川桥单键旋转作为光敏色素中热异构化的通用机制。
Meta-Rc中的发色团烯醇化与质子转移
已经证明Meta-Rc的形成与从蛋白质到溶液相的质子转移耦合，该质子转移可以通过pH敏感指示剂染料检测到。质子再摄取发生在Pfr形成时。这种可逆的质子转移很可能是从Pr到Pfr光转换的普遍特性，因为不仅在Agp1中观察到，也在蓝藻光敏色素Cph1中观察到。在发色团结合口袋中涉及的氨基酸残基中，保守的His250对于质子再摄取很重要，但对于质子释放并非关键。
根据NMR分析，Cph1的Pr态形成两个亚态的平衡，这两个亚态的区别在于His260（Agp1中His250的对应物）的质子化状态。因此，两个亚态之间的转变对应于His260的（去）质子化。鉴于Cph1和Agp1中Pr态结构异质性的相似性，相同的保守His残基质子化模式可能存在于Agp1中。具体而言，His250在生理pH附近的pKA值与其最初在质子易位中的作用一致。从Meta-Ra到Meta-Rc的转变伴随着发色团的烯醇化和去质子化，这促进了质子向His250的转移。这一解释与从RR和IR数据推导出的Meta-Rc发色团归属于去质子化烯醇化BV结构一致。因此，阳离子His250可能通过将质子转移给后续质子受体并接受来自BV的质子，在Grotthuss型传输机制中充当从BV到溶液相的质子易位链中的第一环。
质子偶联的发色团与蛋白质结构变化
伴随着Meta-Rc中发色团的烯醇化，我们注意到IR差示光谱的酰胺I区域有非常微小但明确的信号，指示了舌区重构的开始。这种情况让人联想到地下光敏色素Agp2的Meta-F中舌区结构的不稳定化。舌区从β-折叠/发夹到α-螺旋/卷曲结构的完全转变发生在从Meta-Rc到Pfr的过渡期间。因此我们得出结论，发色团释放质子代表了舌区重构的启动信号，但其完成需要发色团的再质子化。这就提出了质子转移、二级结构转变和发色团结构变化如何耦合的问题。
在250至290 K之间的任何恒定温度下，舌区在β-折叠/发夹和α-螺旋/卷曲结构之间形成pH依赖的构象平衡，后者在低pH下占优势。在290 K和pH 7.8时，Pfr占主导，α-螺旋/卷曲舌区是稳定构象，该转变的pKA接近11。相反，在250 K和pH 7.8时，存在Meta-Rc，β-折叠/发夹舌区是稳定构象，pKA明显更低，可能接近6。
由RR光谱反映的发色团构象变化不能像从IR差示光谱推导的那样归入舌区结构的两态方案。从Pfr开始，移至pH 12导致发色团结构与pH 7.8时的Meta-Rc基本相同，表明是去质子化的烯醇发色团。然而，将Meta-Rc从pH 7.8酸化至6.0会导致质子化的酮式互变异构体，其四吡咯几何结构受到扰动，与pH 7.8时的Pfr不同。这个我们称为pre-Pfr的状态的特征是HOOP模式从809 cm-1上移至825 cm-1，C–D伸缩模式从1599 cm-1上移至1604 cm-1。这些光谱变化表明C–D甲川桥单键的二面角减小，而相应双键的二面角增大，导致C–D甲川桥的扭曲角改变。最有可能的是，该状态采用了扭曲的ZZEssa发色团几何结构，该结构在反应序列的最后一步弛豫到Pfr。
从Meta-Ra到Pfr的反应途径方案考虑到了根据微观可逆性原理的逆反应。在pH 7.8时，逆反应基本可以忽略，但当pH升高时，它们变得重要，以至于即使在290 K下平衡也可以移回Meta-Rc。在pH 7.8时，反应序列分别在210 K和250 K下被阻断在Meta-Ra和Meta-Rc。pre-Pfr态在pH 7.8时无法被捕获，很可能是因为它的衰变速度比形成速度快。当pH降低时，情况则不同。此时反应级联在250 K下被阻断在pre-Pfr。该方案意味着Pfr可以通过舌区重构被热转换为Meta-R态，对应于光感受器的失活。这个反应可能是先前观察到的Agp1中Pfr活性随温度升高而降低的基础。有趣的是，其他光敏色素也注意到了这种效应，表明它们具有作为光和温度传感器的能力。
除了动力学描述，该方案还反映了质子转移与蛋白质和发色团结构变化的耦合。从Meta-Ra到Meta-Rc的转变与BV的烯醇化和去质子化相关。发色团结合口袋中的这种重组被舌区感知，舌区被部分去稳定化但仍保持β-折叠结构。随后的质子再摄取导致BV再质子化。因此，酮式互变异构体得以恢复，发色团采用具有扭曲C–D甲川桥双键的ZZEssa构象。因此我们认为，结构和静电变化触发了舌区的α-螺旋形成。在这个pre-Pfr态中，舌区已经采用了其平衡结构，而发色团则需要额外的构象调整，以在最终反应步骤中达到更弛豫的C–D甲川桥几何结构形成Pfr。
结论
对Meta-Rc的光谱分析为理解其作为将发色团光异构化信号传递至光感受器激活的中心枢纽功能提供了新见解。首先，由于D环羰基的烯醇化促进了热Z/E异构化，Meta-Rc开辟了一条返回初始暗态Pr的替代但非生产性反应途径。其次，在生产性途径中，Meta-Rc中的质子易位是触发蛋白质结构变化的关键开关。虽然这只在最后一步反应（pre-Pfr→Pfr）中得到证明，但很可能在整个光转换过程中，质子转移与发色团和舌区的结构重排以交替、逐步的方式发生。这种机制可能也适用于其他原型和地下光敏色素的Pr→Pfr转换，因为它们都经过具有相似光谱特性的Meta-Rc中间体。反向的Pfr→Pr转化也与质子易位耦合，尽管通过不同的机制，正如对地下光敏色素所证明的那样。因此，质子转移与舌区的功能性二级结构转变很可能不仅仅是偶然并行发生，而是存在因果关系。这种关系可能基于与正电荷运动相关的局部电场的实质性变化，该变化可能稳定或去稳定舌区的β-折叠或α-螺旋结构。
