《Environmental Science & Technology》：Beyond Species Richness: A Statistically Rigorous Comparison of eDNA and Conventional Fish Sampling Methods
编辑推荐：
本文综述提出了一种超越传统物种丰富度比较的新多指标统计框架（准确性、一致性、多样性和一致性），用于严谨评估环境DNA（eDNA）元条形码与多种传统鱼类采样方法（电捕鱼、圈网、曳网、米诺鱼陷阱、刺网）的性能差异。作者强调，仅依赖物种丰富度可能导致误解，应通过多维统计证据支撑研究结论，这为生态监测方法选择和数据解释提供了更可靠的基础。
引言：方法比较的挑战与局限
目前存在多种鱼类采样方法，其选择很大程度上取决于评估目标。这些方法主要分为两类：传统方法（如电捕鱼、圈网、曳网、米诺鱼陷阱、刺网）和非传统方法（如环境DNA）。过去比较eDNA与传统方法的研究，大多仅聚焦于检测到的物种，并常将多样性或物种丰富度作为衡量指标。然而，仅凭物种丰富度存在严重局限性，无法评估方法的准确性、性能、可靠性或效率。因为任何一种采样方法都可能存在物种、大小和位置偏差，检测到更多物种并不等同于方法更优。此外，使用香农-维纳指数或辛普森指数等多样性指数时，常以eDNA读数代入计算，但研究表明eDNA读数与物种丰度的相关性微弱甚至不相关，因此这种做法存在问题。鉴于每种采样方法都有其偏倚性，简单地比较一两种方法在逻辑和统计上存在缺陷。为了进行严谨的比较，需要一种整合性的统计方法。
一个多维统计框架的提出
为了克服上述局限，本研究提出了一个利用四种标准化指标的多维统计框架：准确性、一致性、多样性和一致性（图1）。准确性指测量值与真实值之间的接近程度，在鱼类采样中因无绝对“真实值”，故采用方法间的相对准确性。一致性指两个数据集之间冲突信息的水平，即二者在同一时间和地点检测到相同物种的比例。多样性分析不仅包括平均物种丰富度比较，还引入了加权独特性（Weighted Uniqueness）和加权相似性（Weighted Similarity）分析。一致性指集合之间的结构和比例相似性程度，本研究采用RV系数进行分析。这些指标各有限制，但结合使用可进行严谨而全面的分析，从不同层次（概览、深入分析、整合）提取信息（图1，表1）。该框架旨在提供一个可复制的、能产生充分数值证据以支持结论的方法比较方案。
研究方法与实验设计
研究于2023年7月8日至13日在加拿大安大略省北部的四个水体的10个地点进行。比较的七种方法包括：12S元条形码、COI元条形码、电捕鱼、圈网、曳网、米诺鱼陷阱和刺网（图2）。eDNA样本在传统采样前于白天采集，使用OSMOS eDNA采样器。传统方法的采样方案因地点评估目的不同而有所差异，因此数据存在不平衡性。eDNA样本经过过滤、DNA提取、文库构建（使用Illumina流程）后，通过Barque流水线进行分析，使用默认参数和数据库。传统方法则遵循标准操作程序，并由合格的渔业生物学家进行物种鉴定。所有统计分析均考虑了数据的不平衡性。
核心指标的计算方法
准确性：计算为方法A与参考方法B在同一时间和地点检测到相同物种的次数，除以方法A的总物种检测次数（AA）。反之亦然（AB）。
一致性：计算为两种方法同时检测到相同物种的次数，除以所有检测事件（相同+不同）的总和。
多样性：包括配对t检验比较平均物种丰富度、线性混合效应模型进行事后成对比较、加权独特性（Nonly(m)× methods(m)）以及加权相似性分析。
一致性：使用RV系数分析，并通过1000次重复的bootstrap检验显著性，以判断两个矩阵数据是否一致。
研究主要结果
准确性：在个体方法比较中，圈网-曳网、圈网-刺网以及COI-曳网的准确性最高。准确性最低的组合是圈网-米诺鱼陷阱和曳网-米诺鱼陷阱。eDNA标记（12S和COI）与传统方法比较的平均准确性（AA）低于传统方法之间的平均准确性。然而，当以eDNA（12S+COI）为参照时（AB），传统方法的平均准确性是其与其他传统方法比较时的4.14倍。12S与COI相互比较时，COI对12S的准确性为90.32%，而12S对COI的准确性仅为45.16%。
一致性：最一致的个体方法是COI-曳网以及圈网-曳网。最不一致的是圈网-米诺鱼陷阱和曳网-米诺鱼陷阱。平均而言，eDNA标记（12S和COI）与单个传统方法之间的一致性，是传统方法彼此之间一致性的1.93倍。
多样性：eDNA（12S+COI）在所有采样事件中检测到的平均物种数显著高于所有传统方法的总和。12S检测到的平均物种数最多，米诺鱼陷阱最少。在独特性方面，12S的加权独特性最高，圈网和米诺鱼陷阱未获得任何独特结果。在相似性方面，圈网和米诺鱼陷阱的加权相似性最高。
一致性：RV分析显示，21组比较中有7组具有统计显著性。12S数据与刺网数据一致。COI数据则与刺网、圈网、曳网、电捕鱼的数据均一致。电捕鱼与圈网的数据也一致。总体，50%的eDNA（12S & COI）与传统方法的关系是显著的，而传统方法之间仅10%的关系显著。
讨论与核心发现
通过综合四项指标的分析，本研究得出三个主要发现：
- 1.
COI在四项指标中的三项上优于12S：COI与12S相比，具有更高的平均准确性（1.48倍）、一致性（1.33倍）和一致性（与4种传统方法一致，而12S仅与1种一致）。尽管12S检测到更多物种且独特性更高，但其相对较低的准确性、一致性和一致性引发了对其中部分检测结果是否为假阳性的担忧。
- 2.
在COI存在的情况下，曳网在很大程度上是冗余的：COI与曳网在准确性、一致性和一致性三项指标上均表现良好，表明在该研究体系中，COI元条形码有潜力替代曳网这一传统方法。
- 3.
eDNA能描绘更完整的生物多样性图景，但需使用多种标记：当将eDNA（12S+COI）数据与传统方法的组合进行比较时，其平均准确性和一致性均高于与传统方法单独比较的结果。这表明eDNA能捕获比任何单一传统方法更广泛的生物多样性。然而，要实现这一点，必须结合使用多种标记基因（12S+COI）。同时，eDNA也未能检测到传统方法发现的某些物种。
对eDNA元条形码可靠性的思考
研究结果对eDNA元条形码的可靠性提出了关切。eDNA检测到了许多传统方法未发现的物种（可能导致假阳性），同时也漏掉了一些传统方法发现的物种（假阴性）。此外，eDNA被认为具有更广的地理覆盖度和更高的敏感性，理论上应与传统方法（已知存在物种和尺寸选择偏倚）的数据不一致。然而，本研究发现COI与四种传统方法的数据一致，这与“eDNA具有卓越检测能力”的观点相矛盾。这些不一致性强调了在实际应用，特别是保护和管理决策中，需要对eDNA方法进行严格测试和验证。
所提方法的价值与展望
本研究提出的多指标统计框架，从数据中提取了远超单一物种丰富度比较的信息量（共145个数值结果）。该框架灵活，能处理不平衡数据，并能通过推断性统计分析揭示趋势。作者强烈建议研究人员采用此类严谨的统计方法，以最大限度地挖掘数据潜力，减少主观解释偏差，用数值证据支持结论，并发现新的见解。未来的研究应探索不同生境条件和物种组成如何影响这些结果，并致力于提高采样方法的一致性、一致性和准确性。
