《Environmental Science & Technology》：Understanding the Role of Deconjugation of Phase II Metabolites in Wastewater: Implications for Wastewater-Based Epidemiology
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这篇综述深入探讨了II相代谢物（如葡萄糖醛酸结合物和硫酸盐结合物）在污水管网中的稳定性差异及其对污水流行病学（WBE）回算分析准确性的影响。研究通过实验揭示了不同结合类型（酰基-、O-、N-葡萄糖醛酸结合物和O-硫酸盐）在污水中的解离行为，并提出了一个评估框架，以优化WBE工作流程和环境风险评估。
引言背景
污水流行病学（Wastewater-Based Epidemiology, WBE）作为一种新兴的公共卫生监测工具，能够通过分析污水中的人类代谢物来评估社区对特定化学物质的消费或暴露水平，涵盖非法药物、处方药、农药以及内源性标志物等多个类别。在WBE研究中，生物标志物（Biomarker Chemical Indicators, BCI）的选择至关重要，需满足稳定性、来源特异性等要求。人体代谢主要包括I相（如氧化反应）和II相（如结合反应）两个阶段，其中II相代谢通过添加葡萄糖醛酸、硫酸等亲水性基团，促进物质排泄。尽管I相代谢物在WBE中研究较多，但II相代谢物在污水管网中的行为，尤其是其解离（deconjugation）程度，尚未得到充分认识。传统观点认为，由于污水中天然存在高浓度的酶（如β-葡萄糖醛酸酶），II相代谢物会在管网中完全解离，然而这一假设缺乏系统性验证。本研究旨在通过时间变量酶解实验，评估79种常见WBE标志物的II相代谢物稳定性，揭示不同结合类型（酰基-、O-、N-葡萄糖醛酸结合物及硫酸盐结合物）在污水中的解离差异，从而提升WBE回算分析的准确性。
材料与方法
研究选取了涵盖非法药物、生活方式化学品、药物、内源性标志物、食品及个人护理产品（PCPs）等五大类的79种目标分析物。实验采用来自Helix pomatia的β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）和芳基硫酸酯酶（arylsulfatase）进行酶解反应，模拟污水环境中的生物转化过程。未经处理的污水样本在pH 5.0条件下孵育，时间点设置为0、0.5、1、1.5、3、5和18小时，以监测解离动力学。同时，设置了对照样本以排除温度等因素引起的非酶转化。样本经过固相萃取（Solid-Phase Extraction, SPE）处理后，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定性与定量分析。为评估样本储存稳定性，研究还进行了长达180天的冷冻稳定性实验，并考察了室温下（模拟污水输送过程）游离分析物的稳定性。
结果与讨论
酶解过程中的浓度变化
在79种分析物中，43种在酶解后观察到游离分析物浓度显著上升（变化>20%），其中22种在两种酶处理下均呈现增加，证实了II相代谢物在污水中的部分存留。例如，可替宁（cotinine）的N-β-葡萄糖醛酸结合物在β-葡萄糖醛酸酶和芳基硫酸酯酶作用下均快速解离，18小时后游离可替宁浓度增加约92%。相比之下，尼古丁（nicotine）仅在β-葡萄糖醛酸酶处理下显示浓度上升，提示酶特异性可能影响解离效率。另一方面，如贝扎贝特（bezafibrate）等分析物未显示浓度变化，表明其II相代谢物可能在污水中已完全解离或不存在显著结合。值得注意的是，某些化合物如甲基帕拉苯（methylparaben）在初始浓度上升后出现降解，这可能是由于酶制剂中混杂的酯酶或脂肪酶活性导致，强调了使用高纯度酶的重要性。
II相代谢物与游离分析物的同步监测
通过同步监测母体化合物及其II相代谢物，研究直观展示了解离过程。以对乙酰氨基酚（acetaminophen）及其硫酸盐结合物为例，芳基硫酸酯酶处理导致对乙酰氨基酚硫酸盐浓度迅速下降，同时游离对乙酰氨基酚浓度上升，计算显示污水中对乙酰氨基酚硫酸盐初始浓度约占解离后总游离浓度的28%，与尿液排泄数据（30–44%）基本吻合。类似现象也在硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate）等硫酸盐结合物中观察到。
不同酶解平衡的差异
研究比较了两种酶制剂（H-1和H-2）的解离效率，发现对于某些化合物，解离速率和程度存在差异。例如，8-异前列腺素F2a/β仅在H-2酶处理下出现明显色谱峰，而H-1酶则无此效果，这可能与酶制备形式（粉末vs溶液）或次级活性有关。米氮平（mirtazapine）的N-葡萄糖醛酸结合物在H-1酶作用下解离更快，但最终解离程度相当；而吗啡（morphine）在H-2酶处理下释放的母体化合物更多。这些结果提示，在方法开发中需优化孵育时间，并考虑酶源差异对定量结果的影响。
II相代谢物稳定性排序及其对WBE的启示
基于实验数据，II相代谢物在污水中的稳定性遵循以下顺序：酰基-葡萄糖醛酸结合物 < O-葡萄糖醛酸结合物 < O-硫酸盐 < N-葡萄糖醛酸结合物。酰基结合物（如贝扎贝特、布洛芬、萘普生）在污水中几乎完全解离，未检测到浓度增加；O-葡萄糖醛酸结合物（如吗啡、可待因）平均残留率约9.2%，但个体差异大；O-硫酸盐（如对乙酰氨基酚硫酸盐）平均残留率约42.9%；N-葡萄糖醛酸结合物（如卡马西平、可替宁）平均残留率约44.2%，显示较强持久性。这一排序揭示了不同结合类型在污水管网中的解离潜力，直接影响WBE回算准确性。研究进一步将解离数据与游离分析物的污水稳定性结合，构建了一个风险评估框架（），将分析物归类为“可直接分析”、“需谨慎评估”或“需酶解预处理”等类别，为WBE实践提供实用指南。
冷冻储存稳定性
长达6个月的冷冻稳定性实验表明，II相代谢物的稳定性主要取决于母体化合物本身，而非结合类型。在-28°C条件下，酶活性显著降低，因此结合物的降解与游离分析物的降解行为一致。例如，可替宁及其结合物在冷冻条件下均保持稳定，而5-DHPV（表儿茶素代谢物）则无论游离或结合形式均呈现较差稳定性。
研究局限性与未来方向
本研究存在若干局限性：首先，个体代谢差异（如性别、遗传、饮食、药物相互作用）可能影响II相代谢物的排泄比例，而现有尿液排泄数据通常基于小样本（n < 10），可能无法完全代表社区水平。其次，实验仅在污水液体中进行，未考虑管网中生物膜或不同水力停留时间的影响。此外，温度对酶活性的影响（污水温度通常低于37°C）尚未系统评估。未来研究需扩大分析物范围，并结合实际管网采样，以更全面揭示II相代谢物在复杂污水环境中的行为。
结论与意义
本研究系统评估了II相代谢物在污水中的解离行为，挑战了“污水管网中完全解离”的固有假设。研究证实，不同结合类型的代谢物在污水中稳定性各异，其中N-葡萄糖醛酸结合物和硫酸盐结合物表现出较强持久性，可能导致传统WBE方法低估实际暴露水平。通过建立结合稳定性排序和解离-稳定性评估框架，本研究为优化WBE工作流程提供了科学依据，建议对特定分析物（如吗啡、可替宁等）在样本前处理中纳入酶解步骤，或单独评估其II相代谢物浓度。同时，冷冻稳定性结果表明，样本储存过程中II相代谢物降解风险较低，主要取决于母体化合物性质。这些发现不仅提升了WBE数据的准确性，也对环境风险评估（Environmental Risk Assessment, ERA）中化学物质负载量的估算具有重要参考价值。未来，结合社区级代谢变异研究和实际管网监测，将进一步完善WBE在公共卫生与环境科学中的应用。
