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本文报道了一种利用脂质双层锚定单酶分子，通过单粒子追踪技术证实酶催化反应可显著增强其自身扩散的新方法。研究发现，尿酶在底物存在下扩散系数提升约40%，且效应具有底物浓度依赖性及催化活性依赖性。作者进一步构建了多酶复合体，发现其扩散增强效应更为显著（约150%）。这项工作为在纳米尺度设计和研究活性颗粒提供了新平台。
摘要
酶作为催化化学反应的蛋白质，常被比作纳米尺度的活性胶体颗粒，它们结合反应物并释放产物以实现自我推进。近年来实验证据表明，催化放能反应的酶在催化过程中能够更快地扩散，这一过程被称为“增强扩散”。如果属实，酶驱动的推进作用将有望实现在纳米尺度设计活性材料。然而，这需要在受控良好的条件下进行进一步的实验验证。本研究利用单分子追踪技术，观察了被锚定在流体脂质双层上的酶的运动。脂质双层将运动约束在二维平面，降低了基线扩散以提高检测灵敏度，并可支持多种锚定策略。研究发现，在底物（尿素）存在下，活性尿酶的扩散速度比无底物或被抑制时快约40%，且该增强效应与所使用的锚定方案无关。增强的程度与底物浓度呈比例关系，与先前研究一致。最后，研究还发现，将多个酶组装成更大的复合体会导致更强的扩散增强。这项工作表明，酶可以作为一个平台，用于在纳米尺度创造和研究活性颗粒。
引言：酶作为纳米活性颗粒
酶是催化化学反应的蛋白质。活性胶体通常是微米级的合成颗粒，通过非对称地涂覆酶或其他催化剂来产生溶质梯度，从而推动或拉动颗粒。活性胶体的运动可以用佩克莱数（Pe）来表征，这是一个平流传输速率与扩散传输速率的无量纲比值。大的胶体颗粒由于旋转扩散慢，其Pe > 1，导致持留时间长，运动以平流为主。相比之下，酶的小尺寸导致了高平移和旋转扩散速率，而相对较低的催化周转率则导致平流速率较低。因此，对于单个酶，Pe ? 1，任何由活性诱导的运动都表现为“增强扩散”，即表观扩散系数随着底物浓度的增加而增加。
在过去十年中，多项研究表明具有高周转率的放能酶（ΔG < 0）表现出增强扩散，而另一些研究则未观察到增强效应。如果酶可以作为推进单元，它们将成为一个工程平台，用于在纳米尺度创造新型活性颗粒。理解基本的工程原理将使我们能够制造具有先进特性（如感知和响应环境）的活性、分层组装材料。此外，研究纳米级活性系统对于揭示活细胞中生物过程的潜在物理机制至关重要。
实验方法：脂质双层锚定与单分子追踪
本研究进行了一系列实验，利用光学显微镜和单粒子追踪技术，量化了锚定在流体脂质双层上的单个尿酶分子的运动性。膜锚定相较于先前的单分子方法有几个优势。首先，脂质双层对锚定物施加阻力，减缓了其在二维流体中的扩散。这种降低的扩散速率使得使用标准成像方法表征酶运动变得更加容易。其次，将酶的运动限制在二维平面可防止其离开成像焦平面，从而允许对单个分子进行更长时间的连续追踪（）。第三，膜支持多种成熟的生物分子锚定策略，使得能够通过不同的结合方法进行交叉验证，以排除单一方法可能带来的假象。
研究人员使用了两种结合策略将尿酶锚定到支撑磷脂双层上。第一种方法使用链霉亲和素将生物素化的酶与生物素化的脂质交联（图1A）。第二种方法使用胆固醇修饰的单链DNA与连接到互补单链DNA序列上的酶进行杂交（图1B）。研究人员每天通过光漂白后荧光恢复技术验证支撑脂质双层的流动性和均质性。图1C显示了荧光脂质的代表性时间序列和定量FRAP分析。研究发现，脂质双层表现出有效的恢复，扩散系数在预期范围内，D = 1–2 μm2/s。用荧光标记的交联剂进行的FRAP实验表明，它们也是可移动的（图1D），其扩散系数与脂质相似。研究人员通过双色同时单分子成像和追踪进一步量化了单个交联复合物的扩散。结果表明，荧光标记的链霉亲和素-生物素-尿酶（图1E）和胆固醇-DNA（图1F）结合物一起扩散，证实了酶-交联剂复合物在流体双层内是协同运动的。
为了推导酶的扩散系数，研究人员使用全内反射荧光显微镜成像单个酶，并用标准图像分析程序追踪其运动（图2A）。然后使用得到的轨迹计算均方位移作为滞后时间τ的函数，并拟合线性方程?r2? = 4Dτα，其中D是扩散系数，α是反常扩散指数，前置因子4考虑了二维运动[图2A(ii)]。在每个实验条件下，对大约100个粒子重复此过程。研究人员发现，对于所有拟合，反常扩散指数α在4%的不确定性内等于1，表明测量的单分子扩散是纯布朗运动，既非超扩散也非亚扩散。
结果：单酶扩散增强的量化与表征
研究人员确定了每种条件下扩散系数的累积分布函数，并比较了不同尿素浓度下的CDF（图2B, C）。他们使用每个CDF的中值（定义为CDF等于0.5的位置）来表示每个实验条件的表观扩散系数。
使用任一种锚定方案，研究人员都发现随着底物浓度的增加，脂质锚定的酶表现出增强的扩散。对于生物素-链霉亲和素锚定条件，添加1 mM尿素使扩散系数的分布向比无尿素时观察到的值高出约47%的方向移动（图2B）。研究人员使用Kolmogorov-Smirnov统计检验比较分布，发现这种变化具有统计学显著性。在使用胆固醇-DNA系统时，研究人员也观察到了类似的、具有统计学显著性的扩散系数增加42%。重要的是，在有和无1 mM尿素的情况下对脂质双层进行的FRAP测量显示脂质恢复没有差异，证实了尿素的存在本身不影响脂质双层。这两种锚定方案之间的一致性支持了所观察到的增强效应的稳健性。此外，增强扩散的幅度与之前通过荧光相关光谱测量的尿酶在自由溶液中催化诱导扩散增强的结果一致。
值得注意的是，通过单粒子追踪确定的扩散系数分布范围很广，通常跨越一个数量级以上，这与之前的观察一致。尽管光漂白导致的轨迹长度有限可能导致了这种广度，但研究人员怀疑这里的主要因素可能是被追踪分子所处局部环境中脂质双层的异质性。因此，为了可靠地检测分布的变化，必须在相同的脂质和分子组成下进行比较实验，包括适当的对照，并分析足够数量的分子。研究人员还发现，通过胆固醇-DNA锚定的尿酶的基线扩散系数始终比使用生物素-链霉亲和素连接的慢。考虑到胆固醇在高浓度下会导致双层中的脂质有序排列从而降低其流动性，这个结果并不令人惊讶。当研究人员量化胆固醇锚的扩散和荧光强度时，也发现移动较慢的胆固醇复合物往往更亮，这表明胆固醇也可能在双层内形成小的复合物。
研究人员试图确定在什么尿素浓度下扩散会发生改变，以及效应是否饱和。他们测量了跨越4个数量级尿素浓度下的单分子扩散。为了能在不同条件下直接比较，研究人员首先测量无尿素对照的扩散系数D0，然后在同一样品室内测量存在尿素时的D，并量化每个浓度下D的相对增加。通过在同一样品室内顺序增加尿素浓度，确保了所有测量中脂质组成和蛋白质制备完全相同，从而可以进行直接可靠的比较。研究人员绘制了尿酶扩散系数随尿素浓度的变化（图2D）。研究发现，在最低尿素浓度（0.0125–0.05 mM）下，扩散系数略高，但与同一天测量的无尿素对照在统计学上无法区分。在0.075 mM时，扩散系数比对照高31%。在0.075至0.5 mM之间，扩散系数增加，然后在1 mM以上达到平台期（图2D，较大符号）。在此尿素浓度范围内，扩散系数平均增加34 ± 6%（范围25-66%，误差表示为SEM）。使用KS检验，研究人员证明，与同一天的无尿素对照相比，这些增加都具有统计学显著性。观察到的平均增加与之前几项通过其他方法量化自由扩散尿酶的研究中观察到的增强相似。这种清晰的尿素浓度依赖性表明，酶与底物的结合或酶活性与增强扩散相关。
验证催化活性依赖性
为了测试增强扩散是否源于酶活性，研究人员测量了被一种叫做儿茶酚的小分子抑制的尿酶的运动性。他们通过在板式读数分光光度计中监测560 nm处的吸光度来验证尿酶抑制，其中使用70 μM酚红作为pH指示剂。由于尿酶产生碱性反应产物，酚红能灵敏地反映酶活性。在测定中，未处理的酶显示560 nm处吸光度增加，而被抑制的酶没有变化，证实了抑制成功（图3A）。
使用被抑制的酶，研究人员在同一样品室中进行了相同类型的单分子扩散测量，分别在0和1 mM尿素条件下。他们观察到，与对照相比，被抑制的尿酶在尿素存在下扩散系数没有显著变化[图3B(i,ii)]。这一结果支持了尿酶的增强扩散是由其催化活性驱动的结论，并进一步证明尿素不太可能改变脂质双层本身的流动性。
多酶复合体：更大的增强效应
实验结果表明催化活性与增强扩散相关。因此，研究人员假设增加每个复合体的活性位点数量可能会进一步放大这种增强。为了验证这一想法，研究人员利用链霉亲和素的多价性，通过混合链霉亲和素与生物素化的酶，创造出更大的生物素化尿酶复合体。每个链霉亲和素分子拥有四个生物素结合位点，允许其结合1-3个酶，同时保留一个可用的位点连接到生物素化的脂质双层，从而实现单分子追踪（图4A）。此外，如果用多个链霉亲和素制造复合体，可以纳入更多酶，提供更多可用的催化位点。
为了验证这种多酶复合体组装策略，研究人员通过荧光成像估算了每个复合体中包含的酶分子数量。尽管单个酶和多酶复合体都表现为单个衍射极限斑点，但它们的荧光强度因每个复合体中标记酶的数量而异。因此，研究人员测量了图像序列第一帧中每个粒子的背景扣除荧光强度，并比较了单酶粒子和多酶复合体的强度分布。对于单个酶，强度分布呈高斯分布，峰值强度约在6000 AU[图4B(i)]。有趣的是，多酶复合体的分布保留了在6000 AU的初始峰值，并显示出高达初始峰值强度约8倍的更高强度值[图4B(ii)]。考虑到尿酶的标记效率在0.1到0.7之间，研究人员推测单酶的单一峰值强度分布主要来自标记有一个荧光团的单个尿酶分子，偶尔的双标记解释了延伸到约15000 AU的小尾巴。分布的宽度可能反映了单个荧光团的固有荧光涨落。相比之下，多酶复合体观察到的更宽分布意味着每个复合体中存在多个尿酶分子。然而，精确量化每个复合体中的酶数量是具有挑战性的，因为单个酶可能携带不同数量的荧光团。尽管如此，扩展到更高强度值的强度分布的出现证实了个体复合体中存在多个酶，验证了组装策略。
如前所述，研究人员进行了单粒子追踪实验，以确定多酶复合体在无或有1 mM尿素情况下的扩散系数。他们观察到在1 mM尿素存在下，测得的扩散系数分布发生了具有统计学显著性的偏移（图4C）。使用CDF，研究人员确定了中位数，发现对于多酶复合体，从0到1 mM尿素比较，扩散增加了150%（KS检验）。研究人员还发现，对于相同的酶制备，多酶复合体的中位扩散系数远低于通过生物素-链霉亲和素锚定的单个酶（约低17%）。这种流动性的降低可能是由于酶多聚体具有更大的流体动力学半径。基于推导出的单体、各种多聚体的百分比进行预期扩散系数估算，研究人员发现预期降低到单酶值的约70%。观察到的扩散减少的另一种可能性是，多酶复合体可能通过多个生物素-链霉亲和素连接锚定到脂质双层，从而引入了来自脂质的额外阻力（图4A中最左侧复合体）。总体而言，研究结果表明，将多个酶组装成更大的复合体可能为设计具有可控增强扩散的纳米级活性颗粒提供可行的策略。
总结与展望
总而言之，本研究提出了一套新的实验方法，通过将酶锚定到流体脂质双层上，并利用单粒子追踪技术表征其运动，来验证酶增强扩散现象。锚定的目的既是将运动限制在二维，也是增加阻力以减慢动力学并延长观察时间。它还允许使用互补的锚定方案。脂质锚定的酶表现出底物依赖的增强扩散——由催化周转驱动的扩散速率增加。使用两种互补的锚定策略，研究人员表明单个酶的扩散系数增加了约40%，且与具体的结合方法无关。这种增强与之前关于自由酶扩散增加的报道一致。重要的是，这种效应随底物浓度变化，并在酶活性被抑制时消失，进一步支持了催化依赖的机制。
值得注意的是，研究人员发现，通过生物素-链霉亲和素随机交联多个尿酶形成的更大颗粒表现出比单个酶更大的增强。虽然这项工作没有剖析这种增强背后可能的机制，但它指出了酶在驱动从纳米尺度到微米尺度物体活性运动方面的实际用途。事实上，先前的研究已经表明微米级和宏观级的物体可以由酶反应驱动。未来的工作可以将这些酶与其他纳米级构建块（如聚合物、纳米胶体或DNA折纸）结合起来，创造可定制的活性颗粒，为未来的生物相容性活性材料奠定基础。
近期采用互补单分子技术的研究报告称，在自由扩散系统中未观察到催化依赖的酶扩散增强。相比之下，本研究当前和先前的结果一致表明，当酶被粘性剂减缓或被锚定到流体脂质双层时，在底物催化作用下酶扩散率增加了30%至3倍。在这两种情况下，酶的基线扩散率都大幅降低。因此，研究人员假设，我们的发现与早期观察结果之间明显的差异源于系统基线热运动的差异。由于“增强扩散”的起源可能涉及瞬态的局部应力爆发、构象变化或传递到周围流体的静电扰动——这些机制仍有争议。研究人员推测，粘性环境或脂质锚定可能会延长这些瞬态耦合，使运动的活性成分与背景热涨落相比对迁移率做出更大贡献，从而导致可辨别的扩散率增强。具体来说，当基线酶扩散相对较高时，例如酶在水中自由扩散，任何微弱的活性贡献都可能被布朗运动掩盖，因此在实验上无法检测到。相反，当基线迁移率降低时，例如在粘性或膜锚定环境中，即使是适度的活性效应也可能变得更加明显和可在实验上分辨。这种解释表明，催化依赖性扩散增强的幅度可能不仅取决于酶活性，还取决于酶运作的环境背景。综合来看，我们的发现以及之前的报告表明，降低基线酶迁移率的拥挤或粘性环境对于观察增强扩散至关重要——考虑到许多自然和细胞环境本质上是拥挤的，这是一个有趣的结果。
