《Genes and Environment》：Development of a DNA damage assay system using stable human hepatocytes
编辑推荐：
本文介绍了一种新型体外基因毒性检测系统——γH2AX-SHE，该系统利用稳定表达多种代谢酶和药物转运蛋白的人源肝细胞（HepaSH细胞），通过细胞内ELISA技术定量检测DNA双链断裂标志物γH2AX。研究成功验证了该系统对直接致突变剂（如丝裂霉素C、奥沙利铂）和需代谢激活的间接致突变剂（如苯并[a]芘、马兜铃酸、PhIP）的敏感性，并优化了实验条件（24小时处理、DMSO浓度≤1%）。该体系克服了传统大鼠肝S9代谢系统与人类生理差异大、以及原代人肝细胞变异度高的局限性，为更贴近人体真实代谢环境的基因毒性评价提供了可靠工具。
开发基于稳定人源肝细胞的DNA损伤检测系统（γH2AX-SHE）
引言
在毒理学研究中，克服人类与动物之间的代谢物种差异仍是一个关键挑战。长期以来，大鼠肝脏S9组分一直是体外基因毒性测试中外源性代谢激活的金标准。然而，使用人源S9或原代人肝细胞的经验表明，由于个体间变异度高，这些材料不适合标准化测试。尽管如此，利用更贴近人类生理的代谢系统进行基因毒性评估的兴趣日益增长。
整合类人代谢激活系统到体外实验仍面临重大挑战，因为目前可获得的人肝细胞或人源S9组分常因变异性大而不适用于标准测试。为寻找原代人肝细胞的替代来源，研究人员进行了持续探索。源自人诱导多能干细胞（iPS）的肝样细胞已显示出检测代谢介导毒性的能力，但iPS细胞的基因组不稳定性是其用于基因毒性评估的根本顾虑。此外，表达人细胞色素P450（CYPs）酶的基因工程人源细胞系也已开发出来，这些重组细胞具有表型稳定、靶向CYP物种高表达和快速增殖的优点，适用于代谢途径已知的化合物测试。
本研究所用的HepaSH细胞是市售的稳定人源肝细胞。冷冻保存的原代人肝细胞在免疫缺陷小鼠中孵育扩增后，作为HepaSH细胞提供。HepaSH细胞在体外能稳定表达多种代谢酶和转运蛋白长达一个月。由于这些细胞高度分化且不增殖，传统的基因毒性终点如微核形成、染色体畸变或突变集落测定并不适用。因此，本研究开发了一种细胞内ELISA系统，用于在HepaSH细胞中测量DNA损伤标志物γH2AX。
材料与方法
本研究使用的化学品包括直接致突变剂丝裂霉素C（MMC）和奥沙利铂，需代谢激活的致突变剂苯并[a]芘（BaP）、马兜铃酸（AA）和2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶（PhIP），以及非致突变剂十二烷基硫酸钠（SDS）和氯化钠。测试化合物溶解于二甲基亚砜（DMSO）或培养基中，并用培养基适当稀释。
实验采用来自三位人供体的HepaSH细胞（HepaSH-E、HepaSH-AD、HepaSH-L）。将细胞接种于胶原I包被的96孔板，密度为5×104个细胞/孔，用接种培养基培养4小时后，维持在Power Primary HEP培养基中。在处理测试物前，细胞培养5至7天。
细胞内ELISA方法在之前描述的基础上进行了一些修改。将测试物稀释液加入各孔，在37°C、5% CO2条件下孵育0.5至48小时。处理后，细胞用PBS洗涤，用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液室温固定10分钟，再用PBS洗涤，用99.5%乙醇透化，密封并保存于-20°C直至使用。弃去乙醇后，用1%牛血清白蛋白（BSA）溶液封闭1小时。去除封闭液后，用Alexa 488偶联的抗γH2AX抗体室温孵育2小时。随后用PBS洗涤三次，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液室温孵育15分钟以测量DNA含量。使用微孔板读数器测量γH2AX和DNA的荧光强度。每个实验重复进行，计算每次处理的平均荧光强度。
结果
未处理细胞的γH2AX指数
收集了包含三种HepaSH细胞株的246个未处理培养孔的γH2AX指数数据，时间跨度达9个月。γH2AX指数的平均值和标准差分别为1.00和0.09，观察范围从0.78到1.57。排除上下2.5%的数据后，95%百分位范围确定为0.85至1.22。基于此分布，本研究将γH2AX指数大于1.2定义为阳性结果的阈值。
对非致突变性化合物的反应
用SDS和氯化钠处理HepaSH-E细胞24小时，得到了相似的γH2AX指数剂量-反应曲线。仅在观察到严重细胞毒性的最高浓度下，指数才有所增加。在细胞存活率低于60%的剂量下，γH2AX指数超过了1.2的阳性阈值。在没有严重细胞毒性的浓度下，γH2AX指数保持在背景的95%百分位范围内。在SDS或氯化钠的高细胞毒性剂量下，γH2AX的诱导在可重复实验中也得到了一致证实。
对直接致突变剂的反应
HepaSH-E细胞暴露于MMC或奥沙利铂24小时后，γH2AX指数呈现剂量依赖性增加。MMC在1 μM及以上浓度时提高了γH2AX指数，最高指数出现在63 μM，此时检测到最小的细胞毒性。奥沙利铂处理24小时后，在25 μM及更高剂量的重复孔中，γH2AX指数超过了阳性阈值。在100 μM时，奥沙利铂暴露后的细胞存活率为62%。
BaP诱导γH2AX的时间过程
在BaP处理后2、4、8、16、24和48小时，观察到HepaSH-E细胞中γH2AX的诱导。在250 μM时注意到测试化合物有轻微沉淀。在暴露16小时或更长时间后，γH2AX指数的剂量依赖性增加明显。在重复孔中诱导阳性γH2AX指数的最低浓度在16和24小时为8 μM，在48小时为4 μM。峰值指数值从16小时到48小时呈时间依赖性增加。对ELISA测定培养板中的细胞也进行了显微镜观察。在对照孔中观察到几个具有绿色荧光的γH2AX阳性细胞，而在用125 μM BaP处理24和48小时的孔中观察到许多阳性细胞。在48小时处理的孔中，观察到具有皱缩细胞核和浓缩绿色荧光的细胞，这些细胞在24小时处理的孔中不存在。
DMSO浓度对BaP处理后γH2AX诱导的影响
DMSO降低了HepaSH-E细胞中BaP处理后的γH2AX反应。将细胞暴露于含有0.2%至7.0% DMSO的培养基中的200 μM BaP 24小时。在任何DMSO浓度下均未观察到显著的细胞毒性，细胞存活率保持在85%或更高。在DMSO浓度介于0.2%和2.0%之间时，平均γH2AX指数范围为1.50至1.80。当DMSO浓度达到3.0%或更高时，平均γH2AX指数落入阴性范围，低于1.20，尽管在7.0% DMSO时，一个重复孔中观察到了阳性值。
BaP诱导γH2AX的可重复性
三种不同HepaSH细胞株在多个测试日中，BaP处理24小时后诱导γH2AX的结果显示，BaP在所有三种细胞株中都诱导了γH2AX水平的剂量依赖性增加。产生阳性γH2AX指数所需的最低浓度对于HepaSH-E为8或16 μM，对于HepaSH-AD为16 μM，对于HepaSH-L为4 μM。峰值平均γH2AX指数值在HepaSH-E中为2.52–3.69，在HepaSH-AD中为2.30，在HepaSH-L中为2.84。
AA或PhIP诱导γH2AX
在所有三种细胞株中，用AA或PhIP处理24小时后，均观察到γH2AX的剂量依赖性诱导。AA处理后，在HepaSH-AD和HepaSH-L细胞中观察到比HepaSH-E更强的γH2AX诱导。相反，PhIP处理后，HepaSH-AD细胞中的γH2AX诱导似乎弱于HepaSH-E和HepaSH-L。
讨论
本研究开发了一种使用细胞内ELISA测量稳定人肝细胞（HepaSH细胞）中γH2AX水平的测定系统（γH2AX-SHE）。用MMC和奥沙利铂处理后γH2AX水平的剂量依赖性增加表明，γH2AX是非增殖性HepaSH细胞中有用的DNA损伤标志物。由于HepaSH细胞是非增殖性的，本研究中观察到的γH2AX诱导可能归因于转录偶联修复机制。
基于246个HepaSH细胞阴性对照孔积累的数据，我们建立了γH2AX指数的阳性阈值为1.20，将超过此阈值归类为DNA损伤反应的指标。该测定在BaP、AA或PhIP处理后引发了γH2AX水平的剂量依赖性增加。这些阳性基因毒性反应表明，这些人代谢酶在HepaSH细胞中有效激活了测试物，导致DNA损伤，这通过γH2AX-SHE测定成功检测到。这些发现表明，γH2AX-SHE是在模拟人类代谢激活的系统中进行基因毒性评估的有用工具。
非基因毒性剂在本研究中表现出γH2AX指数的“曲棍球棒”型剂量-反应曲线。虽然在高细胞毒性浓度下γH2AX指数过度升高的原因尚不清楚，但之前的报告描述了在高细胞毒性条件下，非致突变性、非致癌性化合物会形成DNA双链断裂，这可能促进了γH2AX的诱导。仅在高度细胞毒性浓度范围内出现的阳性反应在当前使用哺乳动物细胞的标准体外细胞遗传学测定中被认为是生物学上不相关的。基于本研究结果，在细胞存活率低于60%时，γH2AX-SHE中观察到的阳性反应被视为生物学上不相关的。
BaP在8小时或更短时间的暴露后未引发阳性反应，但在16小时后变为阳性。在标准的使用大鼠肝S9的体外基因毒性测试中，推荐的处理时间通常为3至6小时。在这些测定中，测试化合物在加入含有肝S9的培养孔时可以直接与代谢酶相互作用。相比之下，γH2AX-SHE系统要求测试化合物在遇到细胞内代谢酶之前穿过细胞膜。这种差异部分解释了为什么γH2AX-SHE需要更长的暴露时间才能检测到BaP诱导的基因毒性反应。
我们认为24小时处理是γH2AX-SHE的适当实验条件。在本研究中，直接和间接基因毒性化合物暴露24小时后，γH2AX水平的剂量依赖性增加被一致观察到。虽然BaP处理后48小时的γH2AX测量值略高于24小时，但我们不建议采用48小时处理。在用BaP处理48小时后，经常观察到表现出浓缩绿色荧光的皱缩细胞核，而在24小时时则没有。核固缩是由基因毒性应激触发的细胞凋亡的形态学标志。由于垂死细胞不被认为是致癌的直接原因，我们建议在将γH2AX用作基因毒性危害评估的生物标志物时，排除凋亡细胞是更可取的。
关于预孵育和统计评估，我们选择了5至7天的预培养期，这在使用BaP、AA或PhIP处理后一致产生了阳性反应。在体外条件下，HepaSH细胞能维持细胞活力、白蛋白分泌和实验相关的CYP依赖性药物代谢活性长达21天。为了定义阳性标准——γH2AX指数超过1.2——我们没有考虑个体菌株差异，因为来自HepaSH-AD和-E的对照数据不足以建立菌株特异性阈值。需要进一步研究以建立更合适的阳性阈值和用于决策的统计方法。
在培养孔中，DMSO浓度为3%或更高时，BaP诱导的γH2AX受到抑制。相比之下，浓度为2%或更低的DMSO并未抑制BaP诱导的γH2AX。我们建议DMSO浓度不应超过1%，因为DMSO对HepaSH细胞中各种酶活性的影响尚不清楚。在包括体外哺乳动物细胞微核测试、染色体畸变测试和胸苷激酶基因突变测试在内的标准基因毒性测试中，使用1% DMSO是普遍接受的做法。
由BaP诱导的γH2AX的剂量依赖性增加在来自三位供体的HepaSH细胞株中一致地重现。虽然最低阳性剂量和峰值γH2AX水平在不同实验中有所不同，但HepaSH-AD和HepaSH-L的总体剂量反应曲线形状似乎落在使用HepaSH-E进行的四次重复实验的变异范围内。在用AA或PhIP处理后也观察到了菌株特异性差异。这些变异可能反映了个体供体的反应。Uehara等人观察到五种HepaSH菌株中九个CYP基因的相似表达水平。然而，来自具有CYP2C19或CYP3A4弱代谢者基因型的供体的菌株显示出这些酶的代谢活性显著降低。后来的研究报道，与HepaSH-E和-AD相比，HepaSH-L中CYP1A2活性更高，这似乎与PhIP处理后观察到的γH2AX诱导一致。值得注意的是，被CYP1A2激活的PhIP在HepaSH-L中比在HepaSH-E或-AD中更低的剂量诱导了γH2AX。Zerdoug等人证明了暴露于环境化学物质后，HepaSH细胞中CYP的诱导。观察到的HepaSH菌株间的变异可能反映了遗传多态性或酶诱导性的差异。然而，在PhIP处理后，HepaSH-L的重复对照孔中观察到的差异略大于HepaSH-E或-AD，需要进一步确认以阐明菌株变异的程度。
HepG2和HepaRG细胞已被广泛用于模拟人肝代谢的体外实验。HepaRG细胞源自肝肿瘤，由于表达多种I相和II相代谢酶，已被提议作为与人相关的体外基因毒性测试系统。与HepG2细胞相比，HepaRG细胞在检测间接致突变剂的基因毒性潜力方面显示出更高的敏感性。使用HepaRG细胞的彗星实验、微核实验和γH2AX实验成功地指示了对间接基因毒性化学物质的阳性反应。相比之下，HepaSH细胞是非增殖性的，使得彗星实验和微核实验不适用。然而，γH2AX测定仍然是检测DNA损伤的敏感方法。HepaSH菌株来自不同的供体，并且可以容易地添加新的菌株。这种灵活性为旨在阐明个体间变异性的研究以及需要覆盖多样化人群的安全性评估提供了优势。
结论
γH2AX-SHE测定可以作为在模拟人类代谢活性的条件下检测DNA损伤的有用工具。基于研究结果，提出以下建议：24小时的处理期，DMSO浓度不超过1%，并且认识到在高度细胞毒性剂量下观察到的阳性反应——定义为大致低于60%的细胞存活率——可能不具有生物学相关性。
