《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Iron deficiency aggravates hepatic inflammation in suckling piglets via endoplasmic reticulum stress-driven NF-κB pathway activation
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本研究发现，在哺乳仔猪模型中，缺铁（ID）通过诱发氧化还原失衡、抑制核心的Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，从而引发肝脏氧化应激。这进一步激活了未折叠蛋白反应（UPR）的PERK/IRE1α分支，导致内质网应激（ERS）。ERS进而驱动TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活，造成促炎与抗炎细胞因子失衡，最终加剧肝脏炎症损伤。该研究为缺铁相关性肝损伤提供了新的分子机制见解。
引言
铁是维持人类和动物生长发育不可或缺的微量元素，参与氧气运输、细胞信号转导、能量代谢稳态和免疫防御等多种生理过程。然而，铁缺乏症（ID）仍然是全球范围内最普遍的营养性疾病。在养猪生产中，新生仔猪先天性铁储备低，生长迅速，而母乳铁含量不足，加之现代遗传育种技术导致的窝产仔数增加、常规补铁方案的技术缺陷等因素，共同加剧了新生仔猪缺铁性贫血（IDA）的发生率，导致生长迟缓、腹泻、氧化应激和免疫缺陷等临床问题。
肝脏是铁储存和代谢的主要器官，也是关键的免疫枢纽。然而，现有研究多集中于ID对肠道、脾脏和外周血免疫细胞的影响，其对哺乳仔猪肝脏炎症的分子机制尚不明确。内质网（ER）是负责维持细胞内稳态的关键细胞器。在缺铁等病理条件下，蛋白质折叠保真度受损，导致错误折叠或未折叠蛋白在内质网腔内积累，从而引发内质网应激（ERS），激活未折叠蛋白反应（UPR）。ERS已成为连接营养缺乏与组织病理学的关键节点。本研究旨在利用哺乳仔猪模型，探究ID诱导肝脏ERS和炎症的机制，为完善补铁策略和设计靶向疗法提供分子层面的理论依据。
材料与方法
本研究采用了体内和体外模型。动物实验经南京农业大学动物伦理委员会批准。选取同期分娩的仔猪，随机分为正常对照组（NC）和缺铁组（ID）。NC组在出生后第3天和第14天肌肉注射右旋糖酐铁，ID组注射磷酸盐缓冲盐水（PBS），两组均饲喂缺铁配方奶。在21日龄时取样分析。
细胞实验使用AML12小鼠肝细胞系。通过添加铁螯合剂去铁胺（DFO）诱导体外缺铁模型。使用ERS抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）进行干预。
检测指标包括：肝脏铁含量、氧化应激标志物（8-羟基脱氧鸟苷、丙二醛MDA、总超氧化物歧化酶T-SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX、还原型谷胱甘肽GSH）、促炎与抗炎细胞因子（IL-1β、TNF-α等）、ERS/UPR通路相关蛋白（GRP78、p-PERK、p-IRE1α、ATF4、CHOP等）以及TLR4/NF-κB通路相关蛋白（MYD88、p-IκBα、p-NF-κB p65等）。采用组织病理学（H&E染色）、透射电镜（TEM）、RNA测序（RNA-seq）、实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）等技术进行分析。
结果
1. 缺铁破坏哺乳仔猪肝脏铁代谢并诱导氧化应激
与NC组相比，ID组仔猪肝脏铁含量和铁储存核心蛋白铁蛋白重链（FTH）的表达均显著降低。编码铁调节激素hepcidin的HAMP mRNA表达也显著下调，证实了缺铁仔猪模型构建成功。ID导致肝脏氧化应激生物标志物8-OHdG水平显著升高，同时抗氧化酶T-SOD、CAT和GSH-PX的活性分别降低了37.1%、35.7%和40.5%，而脂质过氧化终产物MDA的含量增加了2.7倍。在基因水平上，ID显著下调了抗氧化和氧化还原相关基因（如NRF2、SOD1、CAT、GPX1、HMOX1）的mRNA表达，并上调了KEAP1的表达。这些结果表明，ID通过破坏Nrf2-Keap1抗氧化防御系统，导致仔猪肝脏氧化还原失衡和氧化损伤。
2. 缺铁通过UPR激活诱导哺乳仔猪肝脏内质网应激
组织病理学分析显示，ID组仔猪肝脏出现肝索紊乱、细胞质空泡化、水肿变性和单核炎性细胞浸润。透射电镜进一步显示，ID组肝细胞核膜收缩，粗面内质网（RER）数量减少且池扩张、核糖体脱落。与这些结构破坏一致，ID组肝脏中内质网分子伴侣GRP78的蛋白水平显著上调。同时，UPR传感器PERK（Thr980）和IRE1α（Ser724）的磷酸化水平显著增加，而总ATF6表达不变，表明UPR主要通过PERK和IRE1α分支激活。促凋亡转录因子ATF4及其下游靶点CHOP的蛋白水平也显著升高，证实ERS通过ATF4-CHOP轴驱动肝细胞凋亡。
3. 缺铁诱导哺乳仔猪肝脏炎症并激活TLR4/NF-κB通路
RNA-seq分析表明，ID组仔猪肝脏中免疫相关通路（如细胞因子产生、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路）显著富集。与转录组数据一致，ID组肝脏中IL-1β和TNF-α的含量显著增加。M2型巨噬细胞标志物和抗炎细胞因子的mRNA表达下调，而M1型巨噬细胞标志物和促炎细胞因子的mRNA表达上调。在机制上，ID组肝脏中TLR4、MYD88和RELA（编码NF-κB p65亚基）的mRNA表达显著增加，而NFKBIA（编码IκBα）的表达降低。在蛋白水平上，MYD88的表达以及NF-κB p65和IκBα的磷酸化比例均显著增加。这些结果表明，ID通过激活TLR4/NF-κB信号轴促进仔猪肝脏炎性损伤。
4. 缺铁在肝细胞中诱导炎症和ERS
在AML12肝细胞中，DFO诱导的缺铁同样重现了上述表型的关键特征。ID显著上调了促炎基因的表达，下调了抗炎基因的表达。TLR4/NF-κB信号轴被激活，表现为MYD88表达上调和IκBα、NF-κB p65磷酸化增强。同时，ERS也被诱导，表现为GRP78、ATF4、CHOP蛋白上调以及PERK和IRE1α磷酸化增加。这些体外结果与体内观察结果高度一致。
5. ERS诱导炎症反应和NF-κB通路激活
为了探究ERS在ID诱导炎症中的因果作用，在AML12细胞中使用了ERS抑制剂4-PBA。4-PBA预处理显著降低了DFO诱导的ERS标志物（GRP78、p-PERK、ATF4、p-IRE1α）的上调。同时，4-PBA减轻了ID的促炎效应，下调了促炎细胞因子的表达，上调了抗炎细胞因子IL10的表达。更重要的是，4-PBA介导的ERS抑制减弱了ID诱导的NF-κB通路过度激活，显著降低了IκBα和NF-κB p65的磷酸化水平。这些数据从机制上表明，在铁缺乏条件下，ERS是肝细胞炎症的重要上游驱动因素，而NF-κB信号级联是关键的下游执行者。
讨论
本研究揭示了ID通过氧化应激触发的ERS启动肝脏损伤的恶性循环。具体而言，ID损害了电子传递链功能和铁依赖性抗氧化酶，导致活性氧积累并抑制了Nrf2通路。这种氧化负担激活了UPR的PERK和IRE1α分支，进而促进NF-κB介导的促炎细胞因子转录。研究建立了一个“氧化应激-ERS-炎症”的自我放大循环模型。
铁作为关键电子传递链辅因子（如铁硫簇和细胞色素）的重要组成部分，其缺乏会破坏铁硫簇合成并损害细胞色素功能，从而降低电子传递链效率，增加活性氧生成。本研究中，缺铁仔猪肝脏抗氧化酶活性下调，Nrf2/Keap1-HO-1信号轴功能受损，共同导致抗氧化能力严重削弱。
肝脏免疫平衡的破坏是ID致肝损伤的核心。ID不仅直接损害肝细胞的蛋白翻译效率，影响免疫球蛋白合成，还通过激活TLR4/NF-κB通路，极化了肝脏局部免疫微环境，使促炎状态占主导。尽管炎症本身通常诱导hepcidin上调，但在本研究中，缺铁信号覆盖了炎症刺激，导致HAMP表达被抑制，这是机体增强铁吸收和动员的适应性策略。
ERS是连接ID与肝脏炎症的关键桥梁。ID可能通过破坏铁硫簇生物合成和细胞色素功能来损害线粒体氧化磷酸化，导致活性氧过度产生。同时，肝脏抗氧化酶系统活性下调降低了活性氧清除能力。这些效应共同导致未折叠或错误折叠蛋白异常积累，最终诱导ERS。而ERS的所有三个分支（PERK、IRE1α、ATF6）均可通过不同机制与NF-κB信号形成串扰，驱动炎症反应。本研究中使用4-PBA抑制ERS后，NF-κB活化和炎症均得到缓解，直接证实了ERS在其中的介导作用。此外，炎症与ERS之间存在双向相互作用，炎症细胞因子亦可诱导ERS，形成正反馈环路。
结论
本研究阐明了ID导致肝损伤的一系列相互关联的事件链：ID直接损害电子传递链功能，导致活性氧过度积累；ID状态下调了铁依赖性抗氧化酶的活性，削弱了肝脏清除活性氧的能力；ID还抑制了Nrf2信号通路，加剧了氧化应激。这些积累的活性氧激活了由PERK和IRE1α介导的UPR通路。PERK/IRE1α轴进而激活NF-κB信号通路，触发IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子的释放。这一系列反应建立了一个“氧化应激-ERS-炎症”的自我扩增恶性循环，加重了肝脏损伤。该研究为开发治疗哺乳仔猪缺铁性肝损伤的靶向干预措施提供了重要的理论基础。
