《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Vitamin A-activated PPARγ signaling enhances intramuscular fat accumulation by overriding AMPK-mediated inhibition in late-fattening beef cattle
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本研究挑战了为提升大理石花纹等级而在整个育肥期限制维生素A（VA）的传统行业实践。通过体内外实验，研究证实对沃金黑牛实施晚期育肥阶段VA补充（3000 IU/kg DM）可显著提升优质大理石花纹（A3及以上等级）比例至75%，并改善脂肪酸组成（如提升EPA和DHA）。其核心机制在于，VA通过其活性代谢产物全反式维甲酸（ATRA）激活了以PPARγ为核心的转录网络，驱动脂质合成关键蛋白（FASN, SCD, ACACA, FABP4）表达上调，从而促进肌内脂肪（IMF）沉积。研究意外发现，在这一过程中AMPK通路被同时激活，但功能性验证表明，AMPK在此情境下充当的是代谢传感器和负反馈调节器，而非绝对的脂肪生成抑制剂。这一阶段特异性的干预策略为优化优质牛肉生产提供了新的科学依据。
背景
随着消费者生活水平提高，东亚市场对高品质牛肉的需求日益增长，其中肌内脂肪（IMF）沉积是决定牛肉大理石花纹等级和食用品质的关键因素。长期以来，牛肉产业普遍采用在整个育肥期限制维生素A（VA）的策略来提升大理石花纹，这一做法基于早期研究中观察到的血清VA水平与大理石花纹等级之间的负相关关系。然而，这种持续限制可能带来动物健康风险，并忽略了VA代谢作用的阶段特异性。本研究以沃金黑牛为模型，挑战传统范式，探究在育肥晚期（24-30月龄）补充VA对大理石花纹形成的影响及分子机制。
材料与方法
研究首先在体外利用牛骨骼肌来源细胞（BSMCs）进行验证。在细胞分化晚期（D7-D11）使用不同浓度（0.01, 0.1, 1 μmol/L）的全反式维甲酸（ATRA）处理，通过油红O染色、甘油三酯（TG）定量及蛋白质印迹分析评估其对脂质积累和脂肪生成相关蛋白表达的影响。体内试验则分为两部分：研究一选取85头沃金黑牛，在育肥晚期（24-30月龄）为处理组补充VA（3000 IU/kg DM），对照组不补充，随后在30月龄屠宰，评估胴体性状、大理石花纹等级、血清代谢参数、背最长肌脂肪酸组成及关键蛋白表达。研究二扩大规模，对502头牛实施晚期VA补充，并从中筛选出336头ADH1C基因TT纯合型个体以消除遗传干扰，系统分析不同大理石花纹等级（A1至A4）与血清VA浓度、代谢谱、基因和蛋白表达谱之间的关联。此外，通过转录组测序（RNA-seq）比较A1与A4等级背最长肌的基因表达差异，并利用AMPK抑制剂（Compound C）和激动剂（AICAR）在BSMCs中进行功能验证。
结果
- 1.
ATRA在脂肪分化晚期促进BSMCs脂质积累：体外实验表明，在分化晚期给予ATRA处理能浓度依赖性地增加BSMCs中的脂滴数量和TG含量。同时，脂肪生成关键转录因子PPARγ和终末分化标记FABP4的蛋白表达显著上调，而C/EBPα表达无变化，提示ATRA在晚期分化阶段具有促进效应。
- 2.
晚期育肥补充VA提升大理石花纹等级并改善脂肪酸组成：体内试验证实，补充VA显著提高了血清VA浓度和大理石花纹评分，使≥A3等级的比例达到75%，并首次获得A5等级。与此同时，皮下脂肪厚度降低，体现了VA促进脂肪沉积的组织特异性。脂肪酸组成分析显示，补充VA不仅增加了中链和长链饱和脂肪酸，更显著提升了包括亚油酸、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）在内的多不饱和脂肪酸（PUFA）含量，使得PUFA/饱和脂肪酸（SFA）比值升高，营养品质得到改善。分子水平上，背最长肌中PPARγ、SREBP1和ACACA蛋白表达显著上调。
- 3.
补充VA条件下血清VA水平与大理石花纹等级呈负相关：在对336头遗传背景均一的牛只分析中发现，只有在实施了晚期VA补充后，才观察到血清VA浓度随大理石花纹等级升高（从A1到A4）而逐级显著降低的现象。A4等级牛的血清VA水平显著低于A1等级牛。这表明优质大理石花纹的发展依赖于VA的充足供给和随后的活跃消耗，而非简单的限制。伴随等级提升，眼肌面积、肋肌厚度和肌间脂肪厚度均增加，血清中非酯化脂肪酸（NEFA）和葡萄糖水平升高，提示脂解和能量供应增强。
- 4.
转录组分析揭示AMPK通路与大理石花纹增强同时被激活：比较A1与A4等级背最长肌的转录组，发现A4等级样本中AMPK信号通路被显著激活，这与传统认知中AMPK作为脂肪生成抑制剂的角色相悖。蛋白质印迹验证显示，A4等级牛以及VA处理组的背最长肌和BSMCs中，磷酸化AMPK（p-AMPK）水平均显著升高。
- 5.
AMPK在VA诱导的脂肪生成中充当负反馈调节器：BSMCs的功能验证实验阐明了AMPK的角色。使用AMPK抑制剂Compound C处理，能大幅增强ATRA诱导的脂肪生成和TG积累，并进一步升高PPARγ表达。相反，使用AMPK激动剂AICAR处理，则抑制了ATRA的促脂肪生成作用，并降低了PPARγ和FABP4的表达。这证明，在VA介导的脂肪生成过程中，被激活的AMPK起的是负反馈调节作用，以防止脂质过度积累，但VA激活的PPARγ信号通路能够覆盖AMPK的这种抑制效应。
讨论
本研究的发现颠覆了VA与大理石花纹关系的传统认知，揭示了其作用的阶段依赖性。早期研究显示VA抑制前脂肪细胞分化，而本研究证明在育肥晚期或脂肪细胞分化晚期补充VA，能通过激活PPARγ信号网络，协同上调脂肪酸合成酶系（如FASN, SCD, ACACA）和脂肪酸结合蛋白（FABP4），最终促进IMF沉积。研究揭示的“PPARγ-AMPK”调控轴是核心机制：VA在强力激活PPARγ驱动脂肪生成的同时，也引发了AMPK的磷酸化激活。后者并非阻止脂肪沉积，而是作为代谢传感器和刹车装置，形成一种动态平衡，确保脂肪沉积在可控范围内进行。这种协同激活最终以PPARγ信号占据主导而告终。
结论
本研究证实，对沃金黑牛实施育肥晚期战略性VA补充（3000 IU/kg DM），是一种能显著提升大理石花纹等级（75%达到A3及以上）并改善牛肉脂肪酸营养组成的有效策略。其作用机制在于，VA激活的PPARγ信号通路能够克服同期被激活的AMPK介导的代谢抑制，从而促进肌内脂肪沉积。血清VA水平在70-90 IU/dL区间与优质大理石花纹发育相关。这一发现为优质牛肉生产提供了一种新的、基于精准营养的范式，突破了全程限制VA的传统做法，具有重要的理论和实践意义。未来需在不同遗传背景和生产体系中进一步验证该策略的普适性。
