《Communications Biology》：A practical guide to targeted single-cell RNA sequencing technologies
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这篇综述系统剖析了传统3′/5′端单细胞RNA测序（scRNA-seq）在检测目标转录本（TOI）和序列区域（ROI）时存在的各类偏倚，并全面介绍了靶向测序解决方案（包含捕获、引物设计、扩增、双重PCR、探针杂交五大类）来克服这些局限。文章为研究人员提供了实用的决策树，助其根据实验需求（如检测单核苷酸变异、剪接点、融合断点）选择最适合的靶向方法。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为解析组织中单个细胞基因表达的强大工具。然而，当前主流的高通量3′/5′端scRNA-seq方法仅能检测细胞中10–40%的转录本，且获取的信息通常局限于转录本末端的非翻译区（UTR），导致对转录本内部重要区域（如编码区、突变位点）信息的丢失。这些局限性严重阻碍了研究者对特定目标转录本（Transcripts of Interest, TOIs）和序列区域（Regions of Interest, ROIs）的检测。为此，一系列靶向scRNA-seq方法应运而生，旨在特异性富集TOIs或ROIs，以弥补标准方法的不足。
scRNA-seq中影响TOI和ROI检测的偏倚
标准的3′/5′端scRNA-seq实验流程会引入多种偏倚，影响TOI和ROI的检测。这些偏倚贯穿于整个工作流程，主要可归纳为三类：scRNA-seq协议固有的偏倚、转录本序列特征相关的偏倚以及实验设计选择引入的偏倚。
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单细胞制备：组织解离、细胞分离等步骤可能损伤RNA，导致碎片化或线粒体RNA比例升高，影响TOI检测。
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dT捕获/引物设计与内部捕获：大多数方法通过oligo(dT)捕获带poly(A)尾的mRNA，这排除了非poly(A)化的RNA（如调控RNA）。此外，分子拥挤和空间位阻会阻碍结合，而内部多聚腺苷酸化序列导致的“内部捕获”会产生截短的cDNA，消耗珠子上有限的寡核苷酸，并导致转录本5′端信息丢失。
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逆转录：逆转录效率受转录本二级结构、高GC含量等因素影响，可能导致cDNA合成不完全或引入序列错误。
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模板转换：包括“链入侵”（可能导致嵌合cDNA）和“scRNA-seq模板转换”（依赖逆转录酶末端转移酶活性添加非模板C，然后由模板转换寡核苷酸TSO介导第二链合成）。后者效率不高，导致许多cDNA分子无法完成全长转换。
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较短cDNA的生成：为适配短读长测序，需通过转座酶片段化（Tagmentation）或随机引物法将cDNA缩短至200-600 bp。转座酶插入有序列偏好性，随机引物则可能导致错配延伸。关键在于，cDNA必须在其末端包含细胞条形码和唯一分子标识符（UMI），因此可读取的序列信息通常局限在捕获位点（polyA尾）约600 bp范围内，这使得获取编码序列（CDS）内部信息变得困难。
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PCR偏倚：PCR扩增偏好短且GC含量均衡的cDNA，可能导致低丰度TOIs被高丰度cDNA掩盖。聚合酶的保真度也影响ROI序列的准确性。
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高通量测序：测序深度直接影响低表达TOI的检出概率。读长决定了能否覆盖到远离捕获位点的ROI。不同测序平台（如Illumina, PacBio, ONT）具有不同的错误谱。
基于短读长测序的靶向scRNA-seq策略
为克服上述偏倚，靶向方法在scRNA-seq流程的不同阶段进行干预。根据其富集策略，可分为五大类：
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类别1：靶向捕获：通过在条形码珠上修饰与TOI内部区域互补的寡核苷酸（捕获序列），在逆转录前直接从RNA池中物理捕获目标转录本。代表性方法如DART-seq、RoCKseq和direct capture Perturb-seq。其优势在于从源头富集目标，可绕过不利于逆转录的区域，并能靶向非poly(A)化转录本。局限性包括潜在的脱靶捕获和因RNA二级结构导致的杂交效率低下。
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类别2：靶向引物设计：使用能与转录本或cDNA特定区域结合的引物，来富集ROI或TOI信息。根据引物加入的步骤不同，可作用于第一链cDNA（如RoCK and ROI、Constellation-Seq）、逆转录步骤（如GoT、tss2）或扩增后的cDNA（如Constellation-Seq应用于10× Chromium文库）。这类方法通过定义cDNA的5′端，将信息“移位”到TOI内部，有效缓解了3′/5′端偏倚，并降低了对读长的要求。其局限性在于引物设计的特异性、潜在的非特异性结合以及RNA二级结构对引物结合的影响。
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类别3：靶向扩增：在文库制备后期（通常在cDNA扩增后），使用针对特定ROI或TOI的引物进行额外的PCR，以富集这些区域。代表性方法包括BD Rhapsody平台的靶向扩增模块、TARGET-seq、BART-Seq以及GoT-Splice和scG2P方法的一部分。这类方法操作相对简单，可灵活设计大量引物。但主要挑战在于需与大量背景cDNA竞争，可能导致低丰度靶点富集效率不高，且无法缓解早期步骤（如捕获、逆转录）引入的偏倚。
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类别4：双重靶向PCR：在同一反应体系中，使用两套不同的靶向引物分别扩增基因的不同区域（通常是5′UTR和3′UTR），以获得全长或近全长的转录本信息。代表性方法如GoT和GoT-Splice，特别适用于将体细胞突变（位于ROI）与细胞类型（由TOI表达谱定义）进行关联。其主要优势是能够获得跨越多个外显子的信息，有利于检测可变剪接和突变。局限性在于需要为每个靶基因设计两对引物，多重化程度受限，且扩增效率受两对引物性能共同影响。
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类别5：探针杂交：使用荧光标记的DNA探针与细胞内的RNA靶点原位杂交，然后通过显微成像或测序进行检测。代表性方法如HyPR-seq（基于成像）和HybriSeq（基于测序）。其最大优势是可在完全保留空间位置信息的情况下，对少量预先定义的靶点进行高灵敏度、高多重性的检测，无需逆转录或扩增，避免了相关偏倚。局限性在于通量有限（通常靶点数在百个级别），且无法获得非靶向转录本的全基因组表达谱。
靶向方法在长读长测序和空间转录组学中的应用
靶向策略也被整合到长读长测序（如PacBio, Oxford Nanopore）和空间转录组学技术中，以提升其性能。
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长读长测序：长读长技术能直接测序全长cDNA，但通量较低。通过结合靶向策略（如探针杂交富集scTaILoR-seq，或通过靶向引物进行特异性扩增如HIT-scISOseq），可以富集包含特定条形码或来自目标基因的cDNA，从而提高目标序列的覆盖深度和检测效率。
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空间转录组学：许多空间转录组学方法本质上是靶向的，例如基于探针杂交的（如10x Genomics Visium， 其后续的靶向panel如10x Flex）或基于捕获的（如Slide-seq）方法。这些方法通过在空间位置上捕获特定mRNA，将基因表达信息与组织形态学背景相关联。
选择指南与未来展望
为帮助研究者选择合适的靶向方法，文章提供了一个实用的决策树。决策的关键因素包括：主要目标是增强TOI检测还是ROI检测？需要多高的细胞通量？是否需要保留标准转录组信息？ROI是位于转录本内部还是末端？预算是多少？以及实验室具备哪些技术平台。
未来，靶向scRNA-seq领域的发展方向可能包括：开发能够同时靶向数千个ROI的高多重性方法；创建更灵活、可定制的“按需”靶向panel；将靶向测序与蛋白质组学、表观基因组学等多组学技术更紧密地整合；以及利用人工智能辅助设计最优的靶向策略和数据分析流程。
总之，靶向scRNA-seq方法为克服传统技术的偏倚提供了强大的工具箱。通过明智地选择和运用这些方法，研究者能够以前所未有的精度和深度，探索单细胞中特定的转录本和遗传变异，从而推动基础生物学发现和临床医学研究。
