《Journal of Biotechnology》：Development of a Serum-Free Producer Cell Line Generation Process for Scalable and Efficient rAAV Production for gene therapy applications
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血清无源体系构建及稳定生产细胞系开发为重组腺相关病毒载体规模化制造提供高效解决方案，降低生产成本并适应工业需求。
何塞·米格尔·埃斯坎德尔（Jose Miguel Escandell）| 玛法尔达·迪亚斯（Mafalda Dias）| 玛丽亚·贡萨尔维斯（Maria Gon?alves）| 丹尼尔·派斯（Daniel Pais）| 安德烈亚·康塞桑（Andreia Concei??o）| 阿米特·马图尔（Amit Mathur）| 巴拉克·巴尔瓦（Barak Balva）| 萨拉布·森（Saurabh Sen）| 布鲁诺·菲格罗亚（Bruno Figueroa）| 卡伦·A·文森特（Karen A. Vincent）| 帕特里夏·戈麦斯-阿尔维斯（Patricia Gomes-Alves）
iBET，实验生物学与技术研究所（Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica），邮政信箱12，2781-901，奥埃拉斯（Oeiras），葡萄牙
摘要
重组腺相关病毒（rAAV）基因治疗领域的不断发展，对可扩展且高效的生产平台提出了需求。基于生产细胞系（PCL）的制造平台因具有高生产力和可扩展性而展现出巨大潜力。然而，用于rAAV生产的稳定细胞系的生成通常采用含有血清的工艺，这因动物来源成分的安全性和监管问题而带来风险。在本研究中，我们建立了一种完全不含血清的PCL生成工艺，优化了该工艺的关键步骤，包括用于稳定质粒整合的转染方法、高产细胞池的分离以及支持单细胞克隆的培养基补充。
所开发的无血清工艺生成的克隆PCL在生产力及产品质量方面与传统含血清方法相当。这种方法显著缩短了细胞系生成时间，并解决了与血清补充相关的挑战，使其符合工业要求。这些进展克服了rAAV生产中细胞系开发的关键难题，有助于实现可扩展且高效的生产平台，从而推动基于rAAV的基因治疗的发展。
引言
近年来，在使用重组腺相关病毒（rAAV）进行基因治疗方面取得了显著进展。腺相关病毒（AAV）属于细小病毒科（Parvoviridae），其基因组为单链DNA，大小约为4.7 kb，包裹在蛋白质外壳中。这些外壳具有序列多样性，每种外壳都赋予不同的组织趋向性，从而能够有效靶向特定组织（Zincarelli等人，2008年）。除了利用天然外壳多样性外，最近的研究还集中在外壳工程策略上，以提高感染性和组织趋向性，进一步拓展了基于AAV的疗法的潜力（Meng等人，2024年；Xie等人，2023年）。AAV含有两个基因：rep和cap，分别编码参与复制、组装和病毒包装的九种蛋白质（Naso等人，2017年）。在rAAV载体中，反向末端重复序列（ITR）之间的病毒DNA序列被替换为表达目标基因的4.7 kb DNA。rAAV具有多种优势：有效的基因递送能力、良好的安全性、体内短暂的但稳健的转基因表达，以及与其他载体相比较低的免疫反应（Wang等人，2024年）。因此，rAAV成为体内基因治疗中最常用的病毒载体之一，并展现出巨大潜力。截至2025年，已有超过350项基于重组rAAV系统的临床试验开展，其中七种基因治疗方法获得批准，预计未来几年还将有更多治疗方法问世（Merten，2024年综述）。然而，扩大rAAV的生产规模面临重大挑战。化学、制造和控制（CMC）工艺通常依赖于HEK293细胞的瞬时转染平台，该平台使用两种或三种DNA质粒进行转染。三质粒转染平台通常包括一个编码转基因的顺式作用质粒（两侧带有ITR），以及两个反式作用质粒：一个提供病毒复制和包装所需的辅助功能，另一个编码AAV的Rep和Cap蛋白（Destro等人，2024年）。这种方法适用于小规模生产，但由于可扩展性和原材料成本问题，在商业应用中存在挑战。对于需要系统性给药（如肌肉萎缩症）的疾病而言，这一瓶颈尤为突出，因为rAAV的剂量可能高达每位患者10^15个病毒基因组（vg）（Escandell等人，2022年综述）。以目前的体积生产力计算，每位患者需要一个20 L的生物反应器，这在商业上不可行（Reid等人，2024年）。
与其它平台相比，稳定的生产细胞系（PCL）具有诸多优势。PCL可以全面表征，具有更高的可重复性、可扩展性和效率，简化了生产流程，成本效益高，并且遗传稳定性更强；一旦建立，还能简化rAAV产品的监管审批流程。这些优势有望大幅降低生产成本，使基于rAAV的基因治疗更加普及和负担得起。然而，尽管PCL为基因治疗生产提供了有价值的替代方案，但这些生产系统在进入商业阶段时仍面临挑战。主要限制在于缺乏可靠的细胞系开发方法；只有少数报告描述了针对rAAV生产的PCL生成方案（Martin等人，2013年；Escandell等人，2023年）。值得注意的是，大多数方案包含使用含血清培养基的步骤（例如转染、单细胞克隆）。血清的存在对监管合规性构成重大挑战，因为它增加了引入污染物（如外来因子）的风险。
在本手稿中，我们提出了一种新型的无血清PCL生成方案。通过优化关键参数，我们获得了高生产力的PCL，包括转染方法、选择过程和单细胞克隆培养基的组成。利用这种方法，我们生成的PCL的体积生产力超过10^11 vg/mL，并且产品质量符合预期。我们认为，这些创新的实施代表了基因治疗制造领域的一个进步，有望让更多患者能够获得基因治疗。
章节摘录
细胞与细胞培养
本研究中使用的亲本宿主细胞此前已被证实适合rAAV生产（Chadeuf等人，2000年；J. Escandell等人，2023年；Martin等人，2013年；Tatalick等人，2005年）。亲本细胞和PCL在EX-CELL培养基（Sigma-Aldrich，目录号14591C）中培养，并添加了6 mM谷氨酰胺（Thermofisher，目录号25030）。本研究中评估的补充剂（补充剂I、II和III）来自Advance Instruments，目录编号分别为RS-1205和RS-1105。
结果
PCL的生成包括多个步骤，如转染、稳定质粒整合、抗药性选择和单细胞分离，以建立均质的细胞群体。这些步骤对于提高PCL的生产力、平台稳健性、可重复性和产品质量一致性至关重要。尽管已有使用该宿主的含血清系统生成PCL的两种方法（Escandell等人，2023年；Martin等人，2013年），但本研究旨在...
讨论
基因治疗制造中的主要瓶颈在于现有病毒载体生产方法的可扩展性不足和成本过高（Escandell等人，2022年综述）。虽然PCL广泛用于生物制品的生产，例如基于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的单克隆抗体生产平台，但它们在rAAV生产中的应用仍处于早期阶段。值得注意的是，八个...
资助
本研究由葡萄牙科学技术基金会（FCT）资助，资金来自科学技术与高等教育部（MCTES）的国家拨款，支持项目iNOVA4Health – UIDB/Multi/04462和UIDP/04462，以及LS4FUTURE联合实验室（LA/P/0087）。J.M.E.获得了FCT的科学就业激励计划（2020.01216.CEECIND）的资助。赛诺菲（Sanofi）也是本研究的赞助方。
CRediT作者贡献声明
阿米特·马图尔（Amit Mathur）：形式分析、研究、方法学、可视化。
巴拉克·巴尔瓦（Barak Balva）：形式分析、研究、方法学、可视化。
何塞·埃斯坎德尔（Escandell Jose）：撰写初稿、监督、方法学、研究、资金获取、概念构思。
玛法尔达·迪亚斯（Mafalda Dias）：撰写初稿、可视化、方法学、研究、形式分析。
布鲁诺·菲格罗亚（Bruno Figueroa）：撰写与编辑、监督、资金获取。
卡伦·A·文森特（Karen A. Vincent）：撰写与编辑。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益和个人关系：帕特里夏·戈麦斯-阿尔维斯（Patricia Gomes Alves）表示获得了赛诺菲SA的财务支持。卡伦·文森特（Karen Vincent）与赛诺菲SA存在雇佣关系。布鲁诺·菲格罗亚（Bruno Figueroa）与赛诺菲SA存在雇佣关系。阿米特·马图尔（Amit Mathur）与赛诺菲SA存在雇佣关系。
致谢
作者感谢Gulbenkian分子医学基因组服务团队的技术专长和支持，以及他们在纳米孔测序及相关数据分析方面的协助。同时感谢赛诺菲公司细胞系开发、细胞培养与纯化过程开发及生物分析团队的帮助。图像由Biorender.com生成。
利益声明
B.F、K.V.和A.M.受雇于赛诺菲美国公司，可能持有该公司股份和/或股票期权。
