《Journal of Hazardous Materials》：Polystyrene-nanoplastics-induced unfolded protein response in monocyte-derived macrophages mediates pulmonary fibrosis via oxidative-stress-dependent IL-6 secretion
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纳米塑料（PS-NPs）通过激活巨噬细胞 unfolded protein response（UPR）通路引发氧化应激和IL-6分泌，促进肺纤维化发展，IL-6可作为潜在治疗靶点。
杨轩伟|吴玉琳|朱德林|张佳宇|李晓娟|王明珠|崔晓辉|吴玉彤|文迪|左静|吕平|沈海涛
中国河北医科大学代谢疾病与癌症研究中心（CMCR），石家庄
摘要
微塑料和纳米塑料已成为广泛存在的环境污染物，人们对其对人类健康的影响日益关注。聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）会在肺泡区域积聚，并被认为与肺纤维化的发展有关。然而，PS-NPs引发纤维化性肺病的具体机制仍不明确。巨噬细胞与炎症和纤维化进程密切相关，在机体对环境刺激的反应中起核心作用。本研究旨在探讨PS-NPs是否能够激活肺巨噬细胞从而诱导肺纤维化。我们发现，支气管暴露于PS-NPs会在体内诱导肺纤维化，同时伴有强烈的炎症反应和单核细胞来源的巨噬细胞（MoMs）的促炎激活。具有抗炎作用的溶菌酶D1通过减轻炎症并抑制MoMs分泌促炎细胞因子，有效缓解了PS-NP引起的纤维化。体外实验表明，PS-NPs通过一种依赖氧化应激的机制激活MoMs，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，这一过程涉及IL-6的分泌。机制上，PS-NPs触发了MoMs中的未折叠蛋白反应（UPR），进而驱动氧化应激相关的IL-6分泌并促进分化。PERK通路被确定为主要的UPR途径，并在MoMs中启动了PERK/氧化应激/IL-6信号轴。重要的是，IL-6缺乏（IL-6-/-）小鼠和IL-6中和剂显著抑制了PS-NP引起的肺炎症和纤维化，这突显了巨噬细胞产生的IL-6在此过程中的关键作用。综上所述，PS-NPs通过激活MoMs中的UPR/氧化应激/IL-6信号轴来驱动肺纤维化。这些发现表明IL-6可能是预防环境刺激相关纤维化性肺病的潜在治疗靶点。
引言
随着全球塑料生产和应用的迅速扩张，微塑料和纳米塑料已成为与人类健康密切相关的新兴环境污染物[1]。塑料制品在紫外线辐射、物理磨损和微生物降解作用下会分解成微小碎片或颗粒，包括微塑料和纳米塑料。美国国家海洋和大气管理局将微塑料（MPs）定义为直径小于5毫米的塑料碎片[2]，而纳米塑料（NPs）通常定义为直径小于100纳米的塑料颗粒[3][4]。在各种环境介质、饮用水和食品中均检测到了MPs和NPs[3][4]。商业上常见的塑料成分包括聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯，其中聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）是最重要的类型[5][6]。大量研究表明，PS-NPs暴露在动物模型中可引起多种毒性效应，包括遗传毒性、神经毒性和生殖毒性[7][8][9]。
涉及气管内给予聚苯乙烯MPs（PS-MPs）的实验研究表明，它们能够诱导肺泡上皮损伤、炎症反应和肺组织纤维化[10][11]。与PS-MPs相比，PS-NPs浓度更高、尺寸更小，因此在大气中的移动性更强，能够传播更远的距离[9][12]。由于其在大气中的普遍存在、微小的尺寸、较大的表面积与体积比以及较高的生物渗透性，PS-NPs可以轻易到达肺泡细胞并逐渐积累，可能导致呼吸系统疾病[6][9][12]。研究表明，吸入40纳米的PS-NPs（剂量为5毫克/千克）一周会导致局部和全身性的氧化应激、炎症以及蛋白酶-抗蛋白酶失衡，进而导致呼吸功能下降和类似慢性阻塞性肺病的病变[12]。吸入500纳米的PS-NPs两周会导致肺纤维化，表现为支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞浸润增加[13]。连续七天气管内给予100纳米的PS-NPs会在肺组织中引发严重的胶原沉积[14]。因此，反复暴露于微小PS-NPs对呼吸系统构成严重威胁，并与肺纤维化相关。因此，进一步研究PS-NP诱导肺纤维化的机制十分必要。
作为主要的肺吞噬细胞，巨噬细胞是抵御微生物病原体和环境污染物的第一道防线[15][16]。摄入PS-NPs后，负责清除PS-NPs的巨噬细胞可能会发生溶酶体酶泄漏，从而引发炎症反应[9][17][18]。在纤维化过程中，代谢途径可调节巨噬细胞的激活，促进促纤维化介质的分泌，进而促进肌成纤维细胞的积累[19]。肺巨噬细胞主要包括两种亚型：单核细胞来源的巨噬细胞（MoMs）和组织驻留的肺泡巨噬细胞（TRAMs），它们被确定为晶体二氧化硅颗粒诱导的肺炎症和纤维化的核心调节因子[20][21]。TRAMs起源于胚胎早期的卵黄囊和胎儿肝脏[20][21][22]，在限制炎症和促进组织修复方面起着关键作用。相比之下，MoMs来源于循环中的单核细胞，主要调节炎症反应。长期暴露于颗粒污染物会损害TRAMs的自我更新能力，促进促炎性MoMs的浸润，表明TRAMs与MoMs之间的平衡失调可能破坏肺免疫稳态[23]。巨噬细胞对环境污染物的反应受损与未折叠蛋白反应（UPR）信号通路有关[24]。UPR由经典内质网（ER）应激传感器激活，包括蛋白激酶R样ER激酶（PERK）和激活转录因子6（ATF6）。这一通路是将细胞应激与肺纤维化发展联系起来的成熟机制[25]。除了在上皮细胞和成纤维细胞中的作用外，肺巨噬细胞中的UPR激活也促进了纤维化过程[26]。PS-NPs会诱导活性氧（ROS）的产生，从而在肺组织中引发ER应激[9]。然而，PS-NPs在肺巨噬细胞中激活UPR以驱动纤维化的具体机制尚不清楚。
先前的研究显示，每人每周通过各种途径摄入0.1-5克的微塑料，相当于成年人每天约摄入0.2-9毫克的微塑料[27]。这一范围为环境暴露水平提供了参考。因此，在设计用于模拟潜在人类健康风险的啮齿动物吸入毒性研究中，通常使用2.5-25毫克/千克的实验剂量[9][13][14][28]。为了探究PS-NP诱导肺纤维化的早期机制，我们建立了体内模型，通过气管内给予PS-NPs（剂量为2.5-25毫克/千克）持续两周。该暴露方案已被证明可以诱导肺纤维化。我们还使用体外模型探讨了PS-NPs是否能够激活参与纤维化的巨噬细胞中的UPR。我们的研究阐明了PS-NPs对巨噬细胞功能障碍和炎症细胞因子分泌的影响，以及它们在纤维化发展中的作用。这些发现为PS-NP激活的巨噬细胞通过产生促炎细胞因子促进肺纤维化的免疫毒理学机制提供了新的见解。
试剂
PS-NPs的表征
使用BeNano 90 Zeta仪器通过动态光散射（DLS）技术，测定了30纳米PS-NPs或龙绿色荧光聚合物PS-NPs（初始浓度为100毫克/毫升）在生理盐水、RPMI 1640和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的物理化学性质，包括粒径、表面电荷（Zeta电位）和多分散指数（PDI）。
PS-NPs诱导的肺纤维化伴随炎症反应
使用动态光散射（DLS）技术，在三种不同介质（生理盐水、RPMI 1640和BALF）中测定了30纳米PS-NPs的物理化学性质。分析结果显示，这些纳米颗粒在盐水悬浮液中的粒径均匀、表面电荷（Zeta电位）稳定、多分散指数（PDI）较低，证实了其在这些介质中的稳定性和单分散性（见补充图1A和B）。为了评估急性PS-NPs暴露的纤维化潜力，使用了C57BL/6J小鼠进行实验。
讨论
由于微塑料和纳米塑料在大气中的高移动性和能够深入肺泡区域的能力，呼吸系统容易受到其影响[9][14]。多项研究表明，环境中的PS-NPs污染会导致肺纤维化，这是一种不可逆且进行性的疾病，会加重呼吸困难[9][13][14]。PS-NP诱导的纤维化与多种遗传和环境因素相互作用，如炎症反应和肺泡上皮细胞的变化有关
CRediT作者贡献声明
文迪：验证、监督。左静：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、概念构思。崔晓辉：资源准备、方法学设计。吴玉彤：资源准备、方法学设计。吴玉琳：撰写 – 初稿撰写、资源准备、实验研究、数据分析。吕平：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、概念构思。杨轩伟：撰写 – 初稿撰写、资源准备、实验研究、数据分析。沈海涛：
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（PL项目编号32471181，HS项目编号82471615）、河北省自然科学基金（PL项目编号H2022206551）以及河北省教育厅科研项目（BJK2024049；BJK2024011）的支持。
