《Journal of Hazardous Materials》：Mechanism of Macrophage Mitochondrial Transfer in CBNPs Induced EndMT of Pulmonary Microvascular Endothelial Cells
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碳黑纳米颗粒（CBNPs）通过PANoptosis介导的线粒体转移引发肺微血管内皮细胞终末分化表型，并抑制PINK1/Parkin自噬通路，促进受损线粒体释放，最终导致肺纤维化。该研究建立小鼠模型和共培养系统，验证了IFI27-PINK1轴在调节线粒体转移及肺纤维化进程中的关键作用。
王梦若|王倩|刘青平|张珊珊|谢玉佳|张涛|杨泽|鲍磊|庞亚贤|史东兴|程家骥|牛玉杰|张志宏|张荣
河北医科大学毒理学系，中国河北省石家庄市050017
摘要
碳黑纳米颗粒（CBNPs）已被确定为特发性肺纤维化（IPF）的潜在致病因素，尽管它们诱导内皮-间质转化（EndMT）的具体机制尚未完全阐明。本研究的目的是确定CBNPs是否通过肺泡巨噬细胞（AMs）中的PANoptosis介导的线粒体转移来诱导EndMT。我们建立了一个CBNPs吸入暴露的小鼠模型，以评估肺功能、胶原沉积和EndMT生物标志物。使用肺泡巨噬细胞（MH-S）和肺微血管内皮细胞（MPVECs）的共培养系统来研究PANoptosis诱导线粒体转移的过程。通过Western blot、qPCR、分子对接、共免疫沉淀和生物信息学分析验证了关键机制。结果表明，CBNPs暴露显著损害了肺功能，诱导了胶原沉积，并激活了EndMT。来自CBNPs处理的M-HS的条件培养基通过转移受损的线粒体触发了MPVECs中的EndMT。从机制上讲，CBNPs抑制了PINK1/Parkin的线粒体自噬途径，导致M-HS中的PANoptosis和随后释放的功能障碍线粒体。IFI27被确定为PANoptosis的关键调节因子，它直接与PINK1结合，加剧了线粒体功能障碍。沉默IFI27可以减轻PANoptosis和线粒体转移，逆转MPVECs中的EndMT表型。
总体而言，这些发现表明CBNPs通过线粒体转移在MPVECs中诱导EndMT，IFI27-PINK1轴调节这一转移过程。这种线粒体转移可以作为CBNPs诱导的IPF的新治疗靶点。此外，通过调节IFI27作为调节因子来控制线粒体转移过程可以减轻纳米毒性引起的肺纤维化进展。
引言
碳黑纳米颗粒（CBNPs）是在缺氧条件下通过碳氢化合物热解合成的纳米级碳质物质，是环境颗粒物的关键组成部分，并对大气污染有显著贡献[1]。同时，CBNPs在橡胶、油墨、皮革和化学纤维等多个领域得到广泛应用。由于其均匀的组成和稳定的化学性质，它历来被认为是一种化学惰性物质[2]。纳米毒理学的发展重新引发了人们对纳米级CBNPs毒性的兴趣。流行病学研究和临床前模型表明，CBNPs与呼吸系统、循环系统、免疫系统和神经系统疾病有关，尤其是对呼吸健康有明显影响[3]、[4]。
我们之前的研究表明，CBNPs暴露通过沉积在肺泡区域诱导小鼠发生特发性肺纤维化（IPF），触发炎症反应、上皮损伤以及随后的肺泡间质胶原沉积[5]、[6]、[7]。肺纤维化的核心病理机制涉及肺泡-毛细血管屏障（ACB）的结构破坏，这会触发肺泡上皮细胞中的内皮-间质转化（EMT）和肺微血管内皮细胞中的内皮-间质转化（EndMT）[8]。我们的先前研究表明，CBNPs暴露通过激活Wnt/β-连环蛋白途径直接促进病理性的胶原积累，从而诱导肺泡上皮中的EMT[9]。尽管EMT在纳米颗粒引起的肺纤维化中起重要作用，但研究表明，纳米颗粒暴露会导致纤维化发展过程中的EndMT表型[10]、[11]。EndMT可促使内皮细胞获得间质特性，加剧免疫细胞浸润，并通过破坏内皮屏障功能加速异常的细胞外基质（ECM）沉积[12]。
肺泡微环境由多种细胞类型组成，其特征是细胞间相互作用受到严格调控。这些相互作用的失调被认为是EndMT的关键触发因素，进而促进异常的ECM沉积[13]。研究表明，巨噬细胞（AMs）和血管内皮细胞之间的异常相互作用在纤维化进展中起核心作用[14]。作为该微环境中的免疫哨兵，肺泡巨噬细胞（AMs）位于气液界面，建立第一道防线并直接响应吸入的颗粒物，启动早期纤维化级联反应[15]。据推测，AMs与肺血管内皮细胞之间的相互作用可能触发EndMT，进而促进ECM沉积。
一项研究表明，巨噬细胞衍生的外泌体通过递送miR-92a激活内皮细胞中的ROS/NF-κB途径，诱导线粒体通透性转变孔开放和钙超载，从而加剧内皮屏障的破坏[16]。纳米颗粒引起的损伤的主要机制与线粒体功能障碍密切相关，因为线粒体是细胞能量代谢和氧化还原平衡的核心调节器，它们通过代谢重编程、钙信号调节紊乱和呼吸链-抗氧化剂失衡直接激活EndMT[17]、[18]。此外，来自星形胶质细胞的线粒体可以逆转内皮细胞的功能障碍[19]。进一步的证据表明，工程化的线粒体通过恢复线粒体活力和稳态缓解了IPF[20]。这些发现表明，细胞间的线粒体转移可能是调节内皮细胞线粒体稳态并影响EndMT进展的关键机制。
进一步的研究表明，线粒体转移不仅涉及功能性线粒体的传递，还可能作为释放功能障碍或受损线粒体的途径[21]。具体来说，富含线粒体的巨噬细胞衍生的细胞外囊泡通过破坏骨髓间充质干细胞的线粒体动态加剧了牙周炎中的骨质流失[22]。供体细胞驱动线粒体转移的主要动机包括为受损的受体细胞提供能量和生理修复，在细胞受到压力时释放异常线粒体，以及癌细胞转移突变线粒体以损害受体细胞的免疫功能[23]。因此，假设巨噬细胞对CBNPs的吞噬作用可能导致线粒体损伤和释放，然后传递给内皮细胞，进一步触发EndMT。
阐明线粒体转移需要确定其驱动因素。相关研究表明，颗粒物暴露显著抑制了线粒体自噬，导致受损线粒体未能及时清除并在细胞内异常积累，这种积累可能进一步触发细胞死亡程序[24]。同时，纳米颗粒暴露可在巨噬细胞中诱导凋亡性坏死和pyroptosis，表明AMs在纳米颗粒刺激下表现出多种死亡途径[25]、[26]、[27]。作为结合pyroptosis、凋亡和坏死性死亡的独特形式的炎症性程序性细胞死亡，PANoptosis在免疫调节中起核心作用，其激活可能通过破坏细胞膜完整性或促进囊泡释放来加速受损线粒体向细胞外空间的释放[28]。已有证据表明，巨噬细胞在受到环境压力时通过多种机制释放线粒体，例如巨噬细胞在pyroptosis过程中释放的囊泡包含完整的线粒体，而用LPS处理的巨噬细胞的条件培养基主要含有裸露的线粒体[29]、[30]。基于上述机制，本研究提出了以下科学假设：线粒体自噬缺陷是CBNPs暴露下PANoptosis诱导的异常线粒体转移的关键调节靶点。
为了阐明CBNPs暴露驱动IPF的机制，我们建立了一个CBNPs暴露的小鼠模型，并利用单细胞转录组数据集系统地绘制了纤维化过程中肺细胞群体间的分子相互作用。此外，我们使用M-HS-MPVECs共培养模型来研究AMs是否通过PANoptosis驱动线粒体向MPVECs的转移。我们的发现揭示了CBNPs暴露巨噬细胞中PANoptosis的分子驱动因素，并确定了受损线粒体转移是将PANoptotic细胞死亡与内皮功能障碍联系起来的关键途径。这项研究加深了我们对CBNPs诱导IPF机制的理解。此外，它还为通过调节线粒体转移或PANoptosis途径来缓解CBNPs诱导的IPF提供了可行的靶点。
材料
CBNPs（99.8%）来自中国的CBNPs生产厂。使用Tecnai G220透射电子显微镜（TEM，日本JEOL）表征了CBNPs的大小和形态。使用扫描电子显微镜（SEM，日本Hitachi）观察了CBNPs的表面形态。所有样品在分析前都进行了金颗粒涂层处理。使用Brunauer-Emmett-Teller（BET）吸附法评估了CBNPs颗粒的比表面积
CBNPs暴露条件的表征
在整个实验过程中，严格监测了暴露室内的CBNPs浓度，平均浓度为5.68 ± 8.86 mg/m3（图1A）。通过SEM和TEM确认了CBNPs的三维纳米结构（图1B–C）。SEM显示CBNPs由直径约为54 ± 8 nm的较小颗粒组成（图S1）。CBNPs具有高碳纯度（>99.8%），呈球形颗粒，形成从数十到数百的聚集体
讨论
为了探索CBNPs诱导的肺纤维化机制，我们建立了一个CBNPs鼻部暴露的小鼠模型。观察到CBNPs暴露上调了IFI27的表达，IFI27与PINK1结合促进其降解，从而抑制线粒体自噬并触发M-HS中的PANoptosis。M-HS的PANoptosis导致受损线粒体的释放，这些线粒体随后通过MVs传递给MPVECs。M-HS中的受损线粒体触发了MPVECs的线粒体功能障碍
结论
在这项研究中，我们发现了一种新的机制，即CBNPs暴露通过驱动线粒体转移来促进肺纤维化。具体来说，CBNPs暴露导致M-HS细胞中IFI27的上调，这抑制了PINK1/Parkin途径，从而阻断线粒体自噬并诱导PANoptosis。这一系列事件促进了M-HS细胞中受损线粒体的释放，这些线粒体随后传递给MPVECs。
动物伦理
该动物实验程序获得了河北医科大学（中国石家庄）动物实验伦理委员会的批准。批准编号为IACUC-Hebmu-2022029。
环境影响
随着工业化和城市化的快速发展，经济增长和能源需求持续增加，导致空气污染物排放持续增加。尽管现有研究表明碳黑纳米颗粒（CBNPs）暴露会导致呼吸系统损伤，但其潜在机制尚未完全阐明。本研究旨在使用细胞和
CRediT作者贡献声明
牛玉杰：研究。王梦若：撰写——原始草稿、方法学、数据管理、概念化。张志宏：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。王倩：撰写——原始草稿、可视化、概念化。史东兴：研究。程家骥：研究。刘青平：可视化、方法学。张珊珊：软件、研究。谢玉佳：软件。张荣：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（U24A20772）、山西医科大学公共卫生学院“233”合作项目（HXJF2025004）、河北省研究生创新资助项目（CXZZBS2025109）、山西省高等教育“百亿工程”科技指导项目（BYBLD005）以及河北省医学科学研究计划（20200865）的支持。
