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肿瘤细胞疫苗（WTCVs）通过环糊精酯（如SADBE）修饰，显著提升制备效率（2小时完成）、稳定性和成本效益（约0.20美元/只小鼠）。SE-Vs诱导接触性过敏反应和免疫原性细胞死亡，形成多细胞免疫微环境，促进抗原交叉呈递，使肿瘤抑制率达87%。SBE-Vs兼具预防性和治疗性，与放化疗联用效果更佳，为临床癌症治疗提供新策略。
陈云|郭思思|谭舒妮·布莱恩妮|赵月|程宇|朱伟|赵彦莉
南洋理工大学化学、化学工程与生物技术学院，新加坡南洋路21号，邮编637371
摘要
全肿瘤细胞疫苗（WTCVs）含有多种肿瘤抗原，通过引发全面的免疫反应，在革新肿瘤治疗方面具有巨大潜力。然而，这些疫苗在关键临床试验中的效果有限，主要原因是肿瘤抗原表达不足和抗原呈递不充分。本文介绍了一种基于临床批准的琥珀酸酯的简单且成本效益高的半抗原化WTCVs（SE-Vs）。这种配方可在两小时内制备完成，消除了致瘤性，诱导免疫性肿瘤细胞死亡，并在长达七天的时间内保持稳定性，每只小鼠的制备成本约为0.20美元。接种SE-Vs可触发接触性超敏反应（CHS），并建立多细胞免疫微环境，促进抗原交叉呈递和强大的适应性免疫反应。与不同琥珀酸酯衍生物的比较研究表明，琥珀酸二丁酯半抗原化WTCVs（SBE-Vs）表现更优，预防效果高达87.0%，能够抑制肿瘤发生。作为治疗性疫苗，SBE-Vs可诱导肿瘤消退，20%的治疗小鼠至少70天内无肿瘤。这一WTCVs的进展代表了该领域的重要突破，拓宽了基于半抗原的免疫疗法的应用范围，为临床肿瘤治疗提供了新的视角。
引言
肿瘤疫苗通过利用人体免疫系统，在革新肿瘤疗法方面展现出巨大潜力[1]、[2]。然而，肿瘤抗原的异质性、免疫原性表位不足以及致突变特性等挑战严重阻碍了其发展[3]。全肿瘤细胞疫苗（WTCVs）包含多种肿瘤抗原，通过激活先天免疫并随后引发特异性适应性反应，成为有前景的候选疫苗[4]、[5]、[6]、[7]。不幸的是，临床试验显示WTCVs的客观反应率较低，对患者生存期的改善也较为有限[8]、[9]。这种效果有限的主要原因是肿瘤细胞采用多种逃避机制来规避免疫检测，包括下调肿瘤相关或特异性抗原，以及阻断抗原呈递[10]、[11]、[12]。提高WTCVs免疫原性的努力包括增加抗原可用性和增强抗原呈递的策略（见表S1）。例如，CRISPR介导的基因组编辑[13]，以及结合基于肽、mRNA和DNA的新抗原，已被用于增强抗原展示[10]、[14]。此外，增强抗原呈递的方法还包括诱导免疫性肿瘤细胞死亡[15]、[16]、引入病原体相关分子模式[14]、[17]、[18]、利用干扰素基因刺激因子（STING）通路的协同作用[19]，以及促进内源性佐剂的生成[20]、[21]。尽管取得了这些进展，WTCVs的制备仍然复杂且耗时（>24小时），通常涉及具有潜在未知副作用的材料（如无机纳米颗粒、胎儿有机框架和慢病毒转导），并且需要额外方法来消除致瘤性（如冻融、低温冷冻、光疗或紫外线/X射线照射）（见表S1）。因此，迫切需要开发简单、安全且创新的疫苗，以增强抗原识别并解决抗原呈递的缺陷，从而维持特异性免疫。
半抗原是一种小分子，通常重量不到1000道尔顿，单独使用时无法引发免疫反应[22]。然而，当与较大的载体分子结合时，半抗原可以引发体液和细胞免疫反应[23]。利用这些特性，将WTCVs与半抗原结合可以提高半抗原的免疫原性，使肿瘤抗原更易被免疫系统识别和攻击[24]。此外，半抗原常用于引发类似接触性超敏反应（CHS）的反应[25]、[26]，这种反应能促进细胞因子产生，招募多种免疫细胞，激活先天免疫，并促进抗原交叉呈递[27]、[28]。初步研究表明，用二硝基苯（DNP）和三硝基苯（TNP）等半抗原修饰肿瘤细胞可以增强免疫反应并促进肿瘤消退[29]、[30]。然而，这些疫苗的保质期仅为18小时，在III期临床试验中尚未获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准（品牌名为M?Vax?）。关于基于半抗原的WTCVs的研究仍处于初级阶段，进展缓慢，其大部分潜力尚未得到充分利用[24]。探索新的半抗原以修饰WTCVs至关重要，特别是那些具有良好临床安全记录的半抗原，这对于将这些疫苗推向临床应用至关重要。鉴于免疫学的快速发展，重新评估半抗原化WTCVs及其潜在机制对于深入理解其作用机制非常重要。
受琥珀酸二丁酯（SADBE）在治疗斑秃和疣方面的临床应用的启发，该物质具有抗炎作用、能激活先天免疫并招募巨噬细胞[31]，我们首先开发了一种使用琥珀酸酯对WTCVs进行半抗原化的简单且成本效益高的疫苗配方（SE-Vs）。这种配方每只小鼠的成本约为0.20美元，可在2小时内诱导免疫性肿瘤细胞死亡，储存7天内保持效力，并通过引发CHS来增强抗原呈递。此外，琥珀酸酯含有两个胺反应位点，可与细胞表面或细胞内蛋白质发生单链或双链结合反应[32]。工程化的SE-Vs具有多种优势：（i）在水中的稳定性和结构完整性可长达100天，这归功于与蛋白质的双链结合反应；（ii）消除了致瘤性和危险信号暴露——琥珀酸酯处理可诱导免疫性细胞死亡，从而暴露出如钙网蛋白等危险信号，帮助激活先天免疫；（iii）增强了肿瘤抗原识别——通过半抗原修饰引入“辅助决定簇”可以有效增强免疫原性并促进肿瘤抗原识别；（iv）促进了抗原交叉呈递——半抗原化WTCVs可以触发CHS，促进细胞因子产生，并建立多细胞免疫微环境。这种微环境特别有利于巨噬细胞的招募和激活，可与树突状细胞（DCs）协同作用，增强抗原交叉呈递。在评估的各种琥珀酸酯衍生物中，SADBE半抗原化WTCVs（SBE-Vs）在抗原内化、CHS诱导、抗原呈递和抗原特异性细胞毒性T细胞反应方面表现优异。SBE-Vs作为预防性和治疗性疫苗均有效，能够保护健康小鼠免受肿瘤侵袭，并与多柔比星（DOX）联合使用抑制肿瘤生长。这种创新方法重新激发了对半抗原化疫苗的兴趣，从而扩展了基于半抗原的免疫疗法的应用范围。此外，通过增强WTCVs的先天免疫反应，该策略显著提高了疫苗效力，使其成为临床肿瘤治疗的有希望的候选者。
SE-Vs的制备与表征
琥珀酸酯因其反应协议简单、对多种功能基团具有高耐受性以及通常较高的转化率而受到青睐，这些特性使其易于与氨基发生单链或双链结合反应，从而作用于细胞表面或细胞内蛋白质（图1a）[32]。本文选择了三种常用的琥珀酸酯：琥珀酸二甲酯（SADME）、琥珀酸二乙酯（SADEE）和SADBE，用于修饰和灭活恶性黑色素瘤细胞
结论
癌症疫苗领域包括多种平台，如肽疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、病毒疫苗、肿瘤细胞疫苗和基于树突状细胞的疫苗，吸引了大量关注[46]、[47]、[48]。值得注意的是，基于肿瘤细胞的疫苗是最早在人类临床试验中评估的癌症疫苗平台之一[49]。这些疫苗来源于自体或异体肿瘤细胞，具有广泛的可用性和呈现多种抗原的能力
SE-Vs的制备
收集B16F10细胞，并将其分散在含有不同浓度SADME（0.1、0.5、1和5 mM）、SADEE或SADBE（pH 7.4或pH 9.0）的盐水中，细胞密度为5×10^5个细胞/mL。将细胞悬浮液在37°C下孵育2小时，然后以300 g离心5分钟，并用PBS洗涤三次。将沉淀物分散在PBS缓冲液或去离子水中，并在不同时间用光学显微镜观察。使用Analyze-Measure功能确定细胞大小
CRediT作者贡献声明
陈云：撰写——初稿、验证、方法学、研究。郭思思：方法学、研究。谭舒妮·布莱恩妮：方法学、研究。赵月：方法学、研究。程宇：方法学、研究。朱伟：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、资金获取。赵彦莉：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了广东省基础与应用基础研究基金会（2022A1515110374）、国家自然科学基金（22372061）、广东省珠江人才计划（2019QN01Y314）、广东省引进创新与创业团队计划（2019ZT08Y318）、广东省自然科学基金（2021A1515010724）、广州市科技项目（202102020352和202102020259）的支持
