《Microchemical Journal》：Rapid and sensitive detection of
fusarium graminearum in maize using an RPA–CRISPR/Cas12a system
编辑推荐：
本研究开发了一种结合RPA与CRISPR/Cas12a的检测平台，用于快速、灵敏且特异地鉴定玉米中的镰刀菌属（F. graminearum）。该平台通过靶向EF-1α基因，在20分钟内可检测低至13拷贝的DNA，且在接种后4天即可识别田间感染样本，无需专业知识和昂贵设备，显著优于传统方法。
王艳芬|高旭鹏|李振康|张宏伟|王柳豪|张强|孙菲菲|周峰|于浩
河南省科学院植物保护与环境学院，新乡453003，中国
摘要
Fusarium graminearum是一种破坏性真菌病原体，会导致玉米、小麦和大麦等谷物作物发生严重病害。在玉米中，它是导致茎秆腐烂的主要致病因子，导致产量大幅下降，并产生威胁人类和动物健康的霉菌毒素。本研究提出并评估了一种新型核酸检测平台，该平台结合了重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR/Cas12a系统，用于快速识别玉米中的F. graminearum。通过靶向翻译延伸因子1α（EF-1α）基因，该检测方法能够将F. graminearum与具有高度保守性的相关物种区分开来。经过系统优化后，所提出的方法使用侧向流动条（LFS）和绿色荧光可视化技术，对F. graminearum的检测表现出高灵敏度和特异性。该方法能够在20分钟内检测到低至0.63 pg（13个拷贝）的F. graminearum DNA，并且在接种后4天内就能可靠地识别出玉米胚芽鞘和田间样本中的感染。值得注意的是，这种方法提供了一种快速、灵敏且特异性的F. graminearum可视化、检测和鉴定方法，无需专门的技术知识或昂贵的仪器设备。通过将CRISPR/Cas12a的特异性与RPA的快速扩增能力相结合，该检测方法成为玉米生产系统中早期准确检测病原体的强大工具。
引言
玉米（Zea mays L.）是一种重要的谷物作物，在全球范围内广泛种植，用于食品和动物饲料。根据联合国粮食及农业组织的数据，2023年全球玉米产量约为12.1亿吨，其中中国贡献了2.77亿吨，占总产量的约22.8% [1]。玉米的生产力受到多种病害的威胁，其中茎秆腐烂尤为严重。这种病害主要由Fusarium属真菌引起[2]，在中国Fusarium graminearum是主要的致病菌种。最近，有报道称Bipolaris maydis也是中国河南省茎秆腐烂的另一种致病因子[3]，而在印度Trichoderma属真菌也成为该病害的新病原体[4]。
Fusarium病原体不仅会降低作物产量，还会产生有害的霉菌毒素，如毒性次级代谢产物脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），这引发了全球对食品安全的担忧[5]、[6]、[7]。F. graminearum是导致玉米茎秆和穗部腐烂的主要病原体，也是DON的主要产生者[8]。它进入食物链对人类和动物健康构成严重风险，因此迫切需要早期和准确的病原体检测[9]。
传统的F. graminearum鉴定方法依赖于耗时的培养和形态学分析，这些过程需要专门的技术知识，无法满足快速检测的需求。相比之下，分子检测方法具有更高的特异性、灵敏度和效率[10]。在过去十年中，包括PCR、实时PCR和嵌套PCR在内的核酸扩增方法被广泛用于病原体检测[11]、[12]。已经开发了许多针对F. graminearum的PCR和qPCR方法，但这些方法依赖于复杂的热循环仪，限制了其在田间的应用。环介导等温扩增（LAMP）是一种适用于现场检测的可行替代方法[16]、[17]，并且已被开发用于F. graminearum的检测[18]。尽管LAMP相比传统方法和实时PCR具有优势，但它容易发生非特异性扩增，且需要温度控制设备（65°C）和1小时的扩增时间[19]、[20]。
最近将CRISPR-Cas系统整合到分子诊断技术中，为高特异性核酸检测开辟了新的途径[21]。与传统方法不同，基于CRISPR的检测方法将扩增与Cas核酸酶（例如Cas12a）的序列特异性识别相结合，当Cas12a与其靶标结合时，会对单链DNA报告基因进行切割[22]、[23]。这种机制可以有效区分真实靶标和非特异性扩增产物，从而解决了LAMP等技术的关键局限性[24]。重组酶聚合酶扩增（RPA）在低温下的快速扩增能力与CRISPR/Cas12a的特异性相结合，已被证明是开发适用于田间检测的各种植物病原体（如Magnaporthe oryzae、F. fujikuroi、F. oxysporum、F. circinatum和F. asiaticum [27]、[28]、[29]、[30]、[31]）的强大工具。
本研究提出并评估了一种新型核酸检测平台，该平台利用RPA和CRISPR/Cas12a系统的协同作用，实现玉米中F. graminearum的快速和特异性鉴定。
真菌菌株来源
F. graminearum分离株来自中国河南省不同地区的受感染玉米茎秆，包括新乡、郑州、濮阳、洛阳和南阳市。此外，还从河南省科学院（新乡）的菌种收藏库中获得了其他常见于玉米的真菌的参考菌株，包括F. proliferatum、F. solani、F. oxysporum、F. verticillioides、Bipolaris maydis和Pythium aphanidermatum。
RPA引物和crRNA的设计与优化
根据RPA指南，基于F. graminearum的EF-α基因手动设计了五对RPA扩增引物（表2）。使用多种Fusarium物种的基因组DNA进行特异性测试后发现，引物对RPA-FgF2/R2对F. graminearum具有高特异性，未观察到在其他物种中的非特异性扩增（图2A-C）。
设计了两种crRNA，以PAM基序（5′-TTC-3′）为靶标，引导Cas12a的转切割。
讨论
本研究提出的新型检测方法包括在39°C下进行10分钟的RPA介导的EF-1α基因扩增，随后在37°C下进行10分钟的CRISPR/Cas12a检测。结果可以通过绿色荧光（470 nm激发波长）或侧向流动条（LFS）读数进行可视化，为不同的田间条件提供了灵活的检测选项。侧向流动条（LFS）因其速度快、操作简单、稳定性高和可视化读数方便而受到广泛应用。
结论
将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a系统结合的双重检测方法在LFS和绿色荧光可视化下证明了对F. graminearum的可靠检测。RPA-CRISPR/Cas12a检测方法显示出高检测特异性和灵敏度，检测限为0.63 pg（13个拷贝）的基因组DNA。该方法还具有快速检测能力，能够在短时间内完成整个过程。由于其便携性和简单性，
CRediT作者贡献声明
王艳芬：撰写——原始草稿、方法学设计、实验研究。高旭鹏：软件开发、实验研究、数据管理。李振康：软件开发、实验研究。张宏伟：方法学设计、数据分析。王柳豪：资源准备、实验研究。张强：验证、数据分析。孙菲菲：方法学设计。周峰：撰写——审稿与编辑、项目监督、概念构思。于浩：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金申请。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢Chillán大学农学系Ernesto A. Moya-Elizondo教授对本文的进一步修订。本研究得到了河南省重点研发项目（编号：231111111000、241111311900）、河南省高校重点科研项目（编号：25B210001）以及HIST大学生创新创业培训项目的支持（编号：10467CXCY2025105）。
