基于哑铃形环滚动环扩增反应的三维DNA纳米球电化学生物传感器，用于超灵敏检测与癌症相关的生物标志物

《Microchemical Journal》：Three-dimensional DNA nanosphere electrochemical biosensor based on the rolling circle amplification reaction of dumbbell shaped ring for the ultrasensitive detection of cancer-related biomarkers

基于D环介导的滚环扩增（RCA）技术构建三维DNA纳米球电化学传感器，实现miRNA-21超灵敏检测（最低29 fM），高特异性且适用于临床血液样本的非侵入式癌症诊断。

李聪聪|徐东洋|孙顺浩|王音

青岛大学附属医院，中国国家卫生健康委员会母婴医学重点实验室，青岛大学附属山东省妇幼保健医院，青岛大学医学院，中国青岛266073

摘要

对临床样本中潜在肿瘤生物标志物miRNA的精确分析有助于癌症的早期诊断和治疗。本文基于哑铃形DNA环（D-ring）介导的滚环扩增（RCA）反应，构建了一种仅使用三条DNA链的三维（3D）DNA纳米球电化学生物传感器，用于超灵敏检测miRNA。具体而言，首先通过Au-S键将发夹捕获探针（HCP）固定在电极表面，随后目标miRNA-21与发夹片段结合。暴露的粘性末端作为引物链触发D-ring的RCA反应。RCA产物中的多个重复互补序列自发杂交并自组装形成DNA纳米球。将电化学指示剂（亚甲蓝，MB）插入DNA纳米球中，从而产生增强的电化学信号。实验验证表明，这种基于3D DNA纳米球的电化学生物传感器能够检测到最低浓度为29 fM的目标miRNA。此外，该传感器在人类血液样本中检测miRNA时表现出高准确性和可靠性，具有在基于核酸的临床诊断中应用的巨大潜力。

引言

微小RNA（miRNA）是一类长度约为18–24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在细胞增殖、分化和凋亡等多种生物过程中通过调节基因表达发挥关键作用[1]。miRNA的异常表达与多种疾病（包括癌症）密切相关。已有研究表明，miRNA-21在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌和前列腺癌等患者的血清中异常表达，并被公认为致癌miRNA[2]、[3]、[4]、[5]。miRNA通过外泌体、凋亡小体或蛋白质结合从癌细胞释放到血液中。由于其稳定性和可检测性，从血液中提取的miRNA已成为癌症研究中的关键生物标志物。作为无创检测方法，检测血液中的miRNA在早期筛查方面具有巨大潜力。准确识别和定量分析miRNA对于疾病诊断、治疗、探索其在特定生物通路中的作用以及相关药物开发具有重要意义。然而，由于miRNA序列较短、同源序列的干扰以及其在生物样本中的低丰度，其后续的准确识别和可靠分析受到严重限制。

目前，已经开发出多种方法用于准确检测miRNA的表达水平。Northern blotting是一种常见的miRNA检测方法，但其存在工作流程复杂、耗时较长和重复性较差等局限性[6]、[7]。作为miRNA检测的金标准，定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）具有高检测灵敏度，但其广泛应用受到引物设计挑战和高成本的限制[8]、[9]、[10]。微阵列检测作为一种高通量检测方法，效率较高，但仅限于半定量分析，操作过程复杂且检测成本较高[11]、[12]。近年来，一些等温核酸扩增技术（如指数扩增技术[13]、链置换扩增技术[14]、[15]、滚环扩增（RCA）[16]、催化发夹组装（CHA）和杂交链反应（HCR）[8]）受到了广泛关注。例如，Suo等人报道了两种基于CHA或HCR扩增策略的电化学生物传感器，显著提高了检测灵敏度[17]、[18]。

RCA是一种等温核酸扩增技术，利用环状DNA模板和链置换DNA聚合酶。在恒定温度条件下，引物与环状模板结合，使DNA聚合酶能够连续循环复制模板，生成由串联重复单元组成的长单链DNA产物。作为一种不依赖热循环的线性扩增方法，RCA消除了对复杂热循环仪器的需求，简化了操作流程并降低了检测成本。与传统PCR相比，RCA在等温条件下进行，机制更为简单，且不易发生非特异性扩增，特别适合用于即时诊断。通过合理设计环状模板，可以生成含有重复功能模块的RCA产物，便于构建多功能DNA纳米结构或作为多种信号标记的载体，从而显著扩展了其在多重检测和生物成像中的应用潜力。

目前，miRNA检测的生物传感器主要依赖于比色[19]、光学[8]和电化学[20]技术。其中，电化学生物传感器因其操作简单和成本效益而受到广泛关注。通过生物识别元件与其目标之间的高度特异性相互作用，电化学生物传感器能够产生易于读取的电信号，从而直接或间接实现对目标的定量分析。结合高灵敏度的信号放大技术，电化学传感器已成为miRNA检测的强大工具。

在RCA过程中，含有串联重复序列的线性DNA在聚合酶的作用下从环状DNA模板快速生成。在本研究中，我们首次开发了一种基于哑铃形DNA环（D-ring）RCA产物的3D DNA纳米球电化学生物传感器用于miRNA检测。目标miRNA作为一种有前景的非侵入性肿瘤生物标志物，与发夹捕获探针（HCP）的发夹结构结合并使其打开。暴露的粘性末端作为引物触发D-ring的RCA反应，形成DNA纳米球。3D DNA纳米球包含大量互补杂交序列，可实现超高的目标检测灵敏度。

部分内容摘录

化学物质和材料

DNA寡核苷酸由Sangon Inc.（中国上海）合成并通过HPLC纯化。所有用于实验的DNA寡核苷酸的碱基序列列在表S1中。6-巯基-1-己醇（MCH）、铁氰化钾（K₃[Fe(CN)₆】、铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆】和氯化钾（KCl）购自Sigma-Aldrich（美国）。Phi29 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自Beyotime Biotech. Inc.（中国上海）。T4多核苷酸激酶（目录编号：M002），

电化学生物传感器的设计与传感原理

这种基于3D DNA纳米球的电化学生物传感器的详细传感原理如图1所示。该传感器包括三个部分：目标识别、基于RCA的信号放大和电化学信号输出。具体来说，经过巯基修饰的HCP链（SH-HCP）通过Au-S键固定在金电极表面，而其余裸露区域被MCH封闭。当引入miR-21D时，SH-HCP链

结论

基于D-ring介导的RCA信号放大技术，我们开发了一种简单的3D DNA纳米球电化学生物传感策略，用于超灵敏检测miRNA。该3D DNA纳米球易于合成，只需使用D-ring作为模板进行RCA反应即可高效组装。所提出的传感器具有高检测灵敏度、宽线性响应范围和优异的检测特异性。

CRediT作者贡献声明

李聪聪：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始稿，可视化，验证，资金获取，概念构思。徐东洋：撰写 – 原始稿，可视化，验证，实验研究。孙顺浩：验证。王音：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本研究得到了山东省自然科学基金（资助编号：ZR2023QH066；ZR2025MS1252）和中国博士后科学基金（资助编号：2023M741854）的支持。